Det Simmons Citrate Agar Det er et fast medium, der anvendes som en biokemisk test til identifikation af mikroorganismer, især gramnegative baciller. Det originale medium blev oprettet af Koser i 1923.
Kosers citratmedium bestod af en bouillon indeholdende natriumphosphat, ammoniumphosphat, monokaliumphosphat, magnesiumsulfat og natriumcitrat..
Som det kan ses, er den eneste kilde til kulstof i mediet citrat, og kvælstof er ammoniumphosphat, idet proteiner og kulhydrater udelades som en kilde til disse elementer, de er almindeligvis til stede i andre medier..
Derfor kan bakterierne podet i dette medium kun reproducere, hvis det er i stand til at optage kulstof fra citrat. Testen var positiv, hvis der var turbiditet i mediet, men den havde den ulempe, at ikke-specifik turbiditet kunne forekomme.
Dette problem blev løst af Simmons ved at tilføje bromothymolblåt og agar til Kosers originale formel. Selv om princippet er det samme, fortolkes det forskelligt.
Artikelindeks
Nogle bakterier har evnen til at overleve i fravær af gæring eller mælkesyreproduktion og har brug for at få energi ved brug af andre substrater. I denne test er den eneste kulstofkilde, der tilbydes, citrat.
Bakterier, der er i stand til at overleve under disse betingelser, metaboliserer hurtigt citrat i en alternativ vej til den traditionelle ved anvendelse af tricarboxylsyrecyklus eller citratfermenteringscyklus..
Katabolismen af citrat af bakterier involverer en enzymatisk mekanisme uden intervention af coenzym A. Dette enzym er kendt under navnet citricase (citratoxaloacetatlyase) eller citratdesmolase. Reaktionen kræver tilstedeværelse af en divalent kation, som i så fald leveres af magnesium.
Reaktionen genererer oxaloacetat og pyruvat, som derefter giver anledning til organiske syrer midt i en alkalisk pH dannet ved anvendelse af kvælstofkilden. Disse organiske syrer anvendes som en carbonkilde, der genererer carbonater og bicarbonater, hvilket yderligere alkaliserer miljøet..
Simmons citratmedium skal inokuleres let i fiskehale ved hjælp af en lige sløjfe eller nål og inkuberes i 24 timer ved 35-37 ° C. Efter tiden observeres resultaterne.
Såningen udføres kun på agarens overflade. Punktering må ikke punkteres.
Hvis mediet forbliver den originale farve (grøn), og der ikke er nogen synlig vækst, er testen negativ, men hvis mediet bliver blåt, indikerer det tilstedeværelsen af alkaliske produkter, som detekteres af pH-indikatoren. I dette tilfælde er testen positiv.
Dette sker, fordi hvis bakterien bruger kulstof fra citratet, er det også i stand til at tage kvælstof fra det ammoniumphosphat, som det frigiver ammoniak med, alkaliserende mediet..
På den anden side, hvis bakterievækst observeres i mediet, men der ikke er nogen farveændring, skal testen også betragtes som positiv, da hvis der er vækst, betyder det, at bakterierne var i stand til at bruge citrat som kulstofkilde , selvom der ikke er nogen ændring i pH i øjeblikket (nogle gange kan det tage tid).
Hvis der er tvivl om fortolkningen af den endelige farve, kan den sammenlignes med et uinokuleret citratrør.
Vej 24,2 g af det dehydrerede medium i en liter vand. Bland og lad den hvile i ca. 5 minutter. Afslut opløsningen af mediet ved opvarmning i 1 eller to minutter og ryster ofte.
Hæld 4 ml i reagensglas og autoklaver ved 121 ° C i 15 minutter. Når du forlader autoklaven, skrå ved hjælp af en støtte på en sådan måde, at agaren størkner i form af en fløjte næb med lille blok eller bund og mere skrå.
Den sidste pH i citratmediet er 6,9 (grøn farve). Dette medium er meget følsomt over for ændringer i pH.
Ved pH 6 eller derunder bliver mediet gult. Denne farve observeres ikke i testen med bakterier.
Og ved pH 7,6 eller derover skifter mediet til en dyb preussisk blå farve..
Simmons Citrate Agar bruges til identifikation af visse mikroorganismer, især de baciller, der hører til Enterobacteriaceae-familien og andre ikke-glukosegærende baciller..
Simmons citratmedium er en meget delikat test, da falske positive kan opnås, hvis der begås visse fejl..
Den omhu, der skal tages, er følgende:
En meget tyk eller fyldt bakteriel inokulum bør ikke fremstilles, da det kan få en kobbergul farve til at udvikle sig på plantestedet uden at påvirke resten af mediet, men det kan føre til at tro, at der er vækst. Det betyder ikke testpositivitet.
Ligeledes kan et tykt inokulum generere en falsk positiv, fordi præformede organiske forbindelser inden for cellevæggene hos døende bakterier kan frigive nok kulstof og nitrogen til at vende pH-indikatoren..
Derfor er idealet at så med nålen i stedet for platinahåndtaget for at undgå at tage overskydende materiale.
På den anden side, når batteriet af biokemiske tests sås til identifikation af den pågældende mikroorganisme, er det vigtigt, at citrat-testen er den første, der podes for at undgå overførsel af proteiner eller kulhydrater fra et andet medium ..
Under denne omstændighed er det muligt at opnå en falsk positiv, fordi ethvert af disse stoffer, der ved en fejltagelse introduceres, metaboliseres og vil medføre en ændring i pH..
En anden måde at undgå overførsel af stoffer er at brænde sløjfen godt og tage et nyt inokulum mellem en test og en anden..
Der skal også udvises forsigtighed, når man rører ved kolonien for at udføre podestoffet, da det bør undgås at trække en del af agaren fra kulturen, hvorfra bakterierne kommer, på grund af ovenstående forklaret.
I denne forstand anbefaler Matsen, Sherris og Branson at fortynde podestoffet i fysiologisk opløsning, inden citrattesten inokuleres for at undgå overførsel af andre kulstofkilder.
Det skal tages i betragtning, at intensiteten af den farve, der produceres, når testen er positiv, kan variere alt efter det kommercielle hus.
Derudover er der mikroorganismer, der tester positive efter 24 timer, men der er andre stammer, der kræver 48 timer eller mere for at frembringe en ændring i pH..
Endnu ingen kommentarer