Sabouraud agar fundament, forberedelse og anvendelser

4392
Basil Manning

Det Sabouraud agar, også kendt som Sabouraud dextrose agar, det er et fast dyrkningsmedium, specielt beriget til isolering og udvikling af svampe, såsom gær, skimmelsvampe og dermatofytter..

Derfor kan dette medium ikke mangle i et mikrobiologisk laboratorium for at undersøge tilstedeværelsen af ​​patogene eller opportunistiske svampe, hverken fra kliniske eller ikke-kliniske prøver. Ligeledes er det også ideelt til vækst af filamentøse bakterier såsom Streptomyces og Nocardias. Dens anvendelse er meget bred, da den kan bruges i human, animalsk, plante- og industriel mykologi.

A. Usædet Sabouraud-agar. B. Sabouraud agar podet med en gær. Kilde: Billeder taget af forfatteren MSc. Marielsa Gil

Dette medium blev oprettet i 1896 af den fremtrædende hudlæge Raimond Sabouraud, som blev en verdenskendt specialist inden for hovedlideforstyrrelser, hovedsageligt forårsaget af dermatofytter..

Dens oprettelse var så vigtig, at den er blevet brugt siden da og forbliver i dag, dog med nogle ændringer.

Selvom det er specielt for svampe, kan bakterier vokse i dette medium, derfor er det nødvendigt at inkludere antibiotika i deres præparat for prøver med blandet flora og dermed hæmme væksten af ​​den bakterieflora, der kan være til stede..

Valget af antibiotikum skal foretages omhyggeligt og under hensyntagen til den type svamp, der skal udvindes, da nogle er hæmmet i nærvær af visse stoffer.

Artikelindeks

  • 1 begrundelse
    • 1.1 Mest anvendte kombinationer af Sabouraud dextrose agar med antibiotika
  • 2 Forberedelse
    • 2.1 Sabouraud dextrose agar 
    • 2.2 Sabouraud dextrose agar (Emmons modifikation)
    • 2.3 Sabouraud dextrose agar (Emmons modifikation) med chloramphenicol
    • 2.4 Sabouraud emmons dextrose-agar med cycloheximid
    • 2,5 Sabouraud dextrose-agar (Emmons) med chloramphenicol og cycloheximid
    • 2.6 Andre antibiotika, der kan tilsættes
  • 3 Særlige overvejelser
  • 4 Kvalitetskontrol
  • 5 anvendelser
    • 5.1 Primær kultur
    • 5.2 Sporulation
    • 5.3 Bevarelse
    • 5.4 Mikrokulturer
    • 5.5 I human mykologi
    • 5.6 Dyremykologi
    • 5.7 Miljømykologi
    • 5.8 Industriel mykologi
    • 5.9 Plantemykologi
  • 6 Referencer

Basis

Sabouraud dextrose agar er et medium, der i sin oprindelige formulering er svagt selektivt på grund af dets sure pH på 5,6 ± 0,2, men bakterier kan stadig udvikle sig, hovedsageligt i langvarige inkubationer.

Mediet indeholder kaseinpepton og fordøjelse i bugspytkirtlen af ​​animalsk væv, som tilvejebringer kilden til kulstof og nitrogen til vækst af mikroorganismer..

Det indeholder også en høj koncentration af glukose, der fungerer som en energikilde, der fremmer væksten af ​​svampe over bakterier. Alt blandet med agar-agar, en komponent, der giver den den rette konsistens..

På den anden side kan Sabouraud dextrose-agar være selektiv, hvis der tilsættes antibiotika..

Med antibiotika er det især nyttigt i prøver af sår, åbne sår eller enhver prøve, hvor der er mistanke om stor bakteriel forurening..

Mest anvendte kombinationer af Sabouraud dextrose agar med antibiotika

-Sabouraud agar med chloramphenicol: ideel til at udvinde gær og trådsvampe.

-Sabouraud agar med gentamicin og chloramphenicol: næsten alle trådsvampe og gær vokser på dette medium og hæmmer et stort antal bakterier, herunder Enterobacteriaceae, Pseudomonas og Staphylococcus.

-Sabouraud agar med cycloheximid: det er især nyttigt til prøver fra huden eller luftvejene, så længe mistanken er dimorfe svampe.

Cycloheximid bør anvendes med forsigtighed; Selvom det bruges til at hæmme væksten af ​​ikke-patogene eller miljømæssige svampe og gær, der kan være til stede som forurenende stoffer i en prøve, hæmmer det også væksten af ​​nogle svampe såsom Cryptococcus neoformansAspergillus fumigatus, Allescheria boydii, Penicillium sp og andre opportunistiske svampe.

-Sabouraud-agar med chloramphenicol plus cycloheximid: anvendes primært til isolering af dermatofytter og dimorfe svampe. Det har den ulempe, at det hæmmer nogle arter af opportunistiske svampe, såsom Candida ingen albicans, Aspergillus, Zygomycetes eller C. neoformans.

-Sabouraud agar med chloramphenicol, streptomycin, penicillin G og cycloheximid: det er ideelt til prøver, der er ekstremt forurenet med bakterier og saprofytiske svampe, men det har den ulempe, at det hæmmer væksten af Actinomyces og nocardias, ud over de ovenfor nævnte opportunistiske svampe.

Forberedelse

Hvis du har ingredienserne separat, kan de fremstilles som følger:

Sabouraud dextrose agar 

Veje:

- 40 gr dextrose

- 10 g pepton

- 15 gr agar-agar

- Mål 1000 ml destilleret vand

Alle ingredienser blandes, pH justeres til 5,6. De opløste stoffer opløses ved kogning, 20 ml af mediet fordeles i rør på 25 x 150 mm uden kant og fortrinsvis med en bomuldshætte..

Rør med bomuldshætte. Kilde: Foto taget af forfatteren MSc. Marielsa Gil

Andre rørstørrelser kan også bruges afhængigt af tilgængelighed.

De autoklaveres i 10 minutter ved en trykatmosfære (121 ° C). Autoklaveringstiden bør ikke overskrides. Når man forlader autoklaven, hældes rørene ved hjælp af en støtte, indtil de størkner i en fløjtestop..

En anden måde er at opløse ingredienserne ved opvarmning indtil kogning. I samme kolbe autoklaveres i 10 minutter og fordeles derefter 20 ml i petriskåle..

Hvis du har et Sabouraud-dextrose-agarmedium, der allerede indeholder alle ingredienserne, skal du fortsætte med at afveje den mængde, der er specificeret af det kommercielle selskab, for en liter vand. Resten af ​​trinene er de samme som dem, der er beskrevet ovenfor.

Sabouraud dextrose agar (Emmons modifikation)

Veje:

-  20 gr dextrose

- 10 g pepton

-  17 gr agar-agar

-  Mål 1000 ml destilleret vand

Alle ingredienser blandes, pH justeres til 6,9. Fortsæt på samme måde som den foregående sag.

Der er kommercielle huse, der tilbyder mediet med alle ingredienser. I dette tilfælde skal du veje og forberede som beskrevet på indsatsen..

Sabouraud dextrose agar (Emmons modifikation) med chloramphenicol

Chloramphenicol stamopløsning

- Vej 500 mg chloramphenicol-base

- Mål 100 ml 95% ethanol

- Blande

Sabouraud-dextrose-agarmedium (Emmons) fremstilles som beskrevet tidligere, og der tilsættes desuden 10 ml chloramphenicol-stamopløsning for hver liter medium inden autoklavering..

Sabouraud emmons dextrose-agar med cycloheximid

Cycloheximid-stamopløsning

- Vej 5 g cycloheximid

- Mål 100 ml acetone

- Blande

Sabouraud-dextrose-agarmedium (Emmons) fremstilles som tidligere beskrevet, og der tilsættes desuden 10 ml cycloheximid-stamopløsning for hver liter medium inden autoklavering..

Sabouraud dextrose-agar (Emmons) med chloramphenicol og cycloheximid

Sabouraud dextrose-agarmedium (Emmons) fremstilles som allerede beskrevet, og der tilsættes yderligere 10 ml chloramphenicol-stamopløsning og 10 ml cycloheximid-stamopløsning før autoklavering for hver liter medium..

Andre antibiotika, der kan tilsættes

20.000 til 60.000 enheder penicillin pr. Liter medium.

30 mg streptomycin pr. Liter medium.

Begge skal indarbejdes, efter at mediet er autoklaveret, let afkølet (50-55 ° C).

0,04 g neomycin pr. Liter medium.

0,04 g gentamicin pr. Liter medium.

Særlige overvejelser

Af hensyn til sikkerheden foretrækkes det at så Sabouraud dextrose-agar i kileformede rør (skrå i fløjte næb) snarere end i petriskåle for at undgå spredning og indånding af sporer.

Det er vigtigt, at Sabouraud-agarrør er dækket af bomuld og ikke med en skruelåg, da semi-anaerobe forhold har vist sig at hæmme spordannelse i nogle stammer, for eksempel Coccidioides immitis. De fleste svampe er også aerobe..

Luk ikke hermetisk i tilfælde af brug af skruehætte.

QA

De forberedte medier skal gennemgå kvalitetskontrol for at kontrollere, at de fungerer korrekt. Til dette sås visse kontrolstammer.

For Sabouraud dextrose agar med chloramphenicol, ATCC stammer af Candida albicans, som skal have fremragende vækst. En anden plade inokuleres med stammer Escherichia coli, skal være fuldstændig hæmmet.

En ikke-inokuleret plade inkuberes også, hvor ingen mikroorganismer skal vokse..

For Sabouraud dextrose agar med chloramphenicol og cycloheximid, stammer af  Trichophyton mentagrophytes, skal udvikle sig godt. En anden plade inokuleres med en stamme af Aspergillus flavus, hvor der skal være ringe eller ingen vækst. Derudover inkuberes en uinokuleret plade for at demonstrere dens sterilitet..

For Sabouraud dextrose agar med cycloheximid, stammer af Candida albicans, Trichophyton rubrum  eller Microsporum canis, som skal vise god vækst.

Ligeledes en stamme af Aspergillus flavus, viser lidt eller ingen vækst. Endelig inkuberes en uinokuleret plade til sterilitetskontrol..

Ansøgninger

Primær kultur

Klassisk Sabouraud dextrose agar indeholder 4 gram dextrose og er fremragende som et primært isolationsmedium, da det viser den karakteristiske morfologi af hver svamp..

Det er også fremragende til at demonstrere pigmentproduktion. Det er imidlertid ikke det mest egnede middel til at observere sporulation..

Det anbefales heller ikke til dyrkning Blastomyces dermatitidis, som hæmmes af den tilstedeværende høje koncentration af glucose.

På den anden side skal visse overvejelser tages i betragtning ved dyrkning.

Nogle svampe vokser bedst ved stuetemperatur, som forme, andre vokser med succes ved 37 ° C, ligesom nogle gær, og andre kan vokse ved begge temperaturer (dimorfe svampe).

Af denne grund er det undertiden nødvendigt at bruge flere Sabouraud-agarplader til den samme prøve, da duplikatsåning ofte udføres for at inkubere en plade ved stuetemperatur og en anden ved 37 ° C..

For eksempel, Sporothrix schenckii den sås i to plader; den ene inkuberes ved stuetemperatur for at opnå formfasen, og den anden inkuberes ved 37 ° C for at opnå gærfasen, men i sidstnævnte er det nødvendigt at tilsætte 5% blod til mediet.

I andre tilfælde, såsom mycetomprøver, frøes to Sabouraud-agarplader, den ene med chloramphenicol og den anden med cycloheximid. Den første vil tillade vækst af forårsagende midler af mycetom af svampeoprindelse (Eumycetoma) og det andet forårsagende middel for mycetoma af bakteriel oprindelse, såsom actinomycetomas..

Sporulation

Sabouraud dextrose agar modificeret af Emmons indeholder 2 gram dextrose og bruges ikke kun til isolering, men også til sporulation og konservering af svampe.

I dette medium, hvis stammer af Blastomyces dermatitidis.

Bevarelse

For at bevare svampekulturer kan de opbevares i køleskab (2-8 ° C). Bevaringstiden kan variere mellem 2 og 8 uger. Efter denne tid skal de subkultureres for at gentage processen..

Nogle svampe holder bedst ved stuetemperatur, f.eks Epidermophyton foccosum, Trichophyton schoenleinnii, T. violaceum Y Microsporum audounii.

Vedligeholdelsen af ​​stammen kan forlænges for at undgå pleomorfisme, hvis dextrose fjernes fuldstændigt fra agaren, og hvis mængden af ​​agar i mediet reduceres for at undgå tørhed.

Mikrokulturer

Til identifikation af nogle filamentøse svampe er det nødvendigt at udføre mikrokulturer ved hjælp af Sabouraud agar eller andre specielle midler til at observere strukturer for seksuel og aseksuel reproduktion..

I human mykologi

Det bruges hovedsageligt til diagnose af svampesygdomme, især dem, der påvirker huden og dens vedhæftede filer (hår og negle).

Prøverne kan være sekreter, ekssudater, hud, hår, negle, sputum, CSF eller urin. Almindeligt isolerede patogener er dermatofytter, svampe, der forårsager subkutane og systemiske mykoser..

Dyremykologi

Dyr er ofte påvirket af svampeinfektioner, derfor er Sabouraud agar lige så nyttig i dyre-mykologi som den er hos mennesker..

For eksempel kan dermatofytter ofte påvirke dyr. Sådan er tilfældet med Microsporum canis var distortum, Det inficerer ofte hunde, katte, heste, grise og aber. Ligeledes, Microsporum gips inficerer hunde, katte og husdyr.

Fugle som kyllinger, hane og kyllinger påvirkes af Microsporum gallinae.

Andre svampe, såsom Zymonema farciminosum, De er også årsagen til sygdom hos dyr, hovedsageligt heste, muldyr og æsler, der forårsager betydelig betændelse i lymfekarene..

Sporothrix schenkii og Histoplasma capsulatum påvirker husdyr og mennesker.

Miljømykologi

Mange patogene eller opportunistiske svampe kan koncentrere sig til enhver tid i et givet miljø, især i operationsstuer og intensivafdelinger på klinikker og hospitaler. Derfor er det nødvendigt at udføre en kontrol af dem.

Andre sårbare rum er biblioteker og gamle bygninger, som kan blive påvirket af koncentrationen af ​​miljøsvampe.

I miljøundersøgelser anvendes Sabouraud dextrose-agar til isolering af svampe..

Industriel mykologi

Sabouraud dextrose agar kan ikke være fraværende til undersøgelse af forurenende svampe i produktionen af ​​blandt andet kosmetik, mad, drikkevarer, læder, tekstiler..

Plantemykologi

Planter lider også af sygdomme forårsaget af svampe, der påvirker forskellige dele af planten, hvilket endda kan afslutte høsten og forårsage store tab i landbruget..

Referencer

  1. Cuenca M, Gadea I, Martín E, Pemán J, Pontón J, Rodríguez (2006). Mikrobiologisk diagnose af mykoser og antifungale følsomhedsundersøgelser. Anbefalinger fra det spanske samfund for infektionssygdomme og klinisk mikrobiologi. Tilgængelig på: coesant-seimc.org
  2. ValteK-laboratorium. (2009). Sabouraud dextrose-agar med cycloheximid. Tilgængelig på: andinamedica.com.
  3. Navarro O. (2013). Veterinær mykologi. National Agrarian University. Nicaragua.
  4. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Bailey & Scott mikrobiologisk diagnose. 12. udgave Argentina. Redaktionel Panamericana S.A
  5. Casas-Rincón G. Generel mykologi. 1994. 2. udgave Central University of Venezuela, Library Editions. Venezuela Caracas.

Endnu ingen kommentarer