Endonukleaser funktioner, typer og eksempler

4473
Charles McCarthy

Det endonukleaser de er enzymer, der skærer phosphodiesterbindingerne inde i nukleotidkæden. Endonukleasebegrænsningssteder er meget varierede. Nogle af disse enzymer skærer DNA (deoxyribonukleinsyre, vores genetiske materiale) næsten hvor som helst, det vil sige de er uspecifikke.

Derimod er der en anden gruppe af endonukleaser, der er meget specifikke i den region eller sekvens, som de skal spalte. Denne gruppe enzymer er kendt som restriktionsenzymer, og de er meget nyttige i molekylærbiologi. I denne gruppe har vi de velkendte enzymer Bam HI, Eco RI og Alu I.

Endonukleaser skærer DNA internt.
Kilde: Pixabay.com

I modsætning til endonukleaser er der en anden type katalytiske proteiner - exonukleaser - der er ansvarlige for at bryde phosphodiesterbindingerne i slutningen af ​​kæden.

Artikelindeks

  • 1 Begrænsningsendonukleaser
  • 2 Funktioner og anvendelser af restriktionsendonukler
    • 2.1 Restriktionsfragmentlængde polymorfisme (RFLP)
  • 3 Typer af restriktionsendonukleaser
    • 3.1 Type I
    • 3.2 Type II
    • 3.3 Type III
    • 3.4 Type IV
    • 3.5 Endonukleaser type V
  • 4 eksempler
  • 5 Referencer

Begrænsningsendonukleaser

Restriktionsendonukleaser eller restriktionsenzymer er katalytiske proteiner, der er ansvarlige for spaltning af phosphodiesterbindingerne inde i DNA-kæden i meget specifikke sekvenser.

Disse enzymer kan købes fra flere bioteknologiske virksomheder, og deres anvendelse er næsten afgørende inden for nuværende DNA-manipulationsteknikker..

Restriktionsendonukleaser navngives ved hjælp af de første bogstaver i det binomiale videnskabelige navn på den organisme, de kommer fra, efterfulgt af stammen (dette er valgfri) og slutter med gruppen af ​​restriktionsenzymer, som de tilhører. F.eks. Er BamHI og EcoRI almindeligt anvendte endonukleaser..

Den region af DNA, som enzymet genkender, kaldes restriktionsstedet og er unik for hver endonuklease, skønt flere enzymer kan falde sammen på restriktionsstederne. Dette sted består generelt af en kort palindrom sekvens, der er ca. 4 til 6 basepar i længden, såsom AGCT (for Alu I) og GAATTC for Eco RI..

Palindromiske sekvenser er sekvenser, der, selvom de læses i 5 'til 3' eller 3 'til 5' retning, er identiske. For eksempel for tilfældet EcoRI er den palindromiske sekvens: GAATTC og CTTAAG.

Funktioner og anvendelser af restriktionsendonukler

Heldigvis for molekylærbiologer har bakterier udviklet en række restriktionsendonukleaser, som internt fragmenterer genetisk materiale.

I naturen har disse enzymer udviklet sig - formodentlig - som et bakteriebeskyttelsessystem mod invasionen af ​​fremmede DNA-molekyler, såsom dem fra fager.

For at skelne mellem nativt og fremmed genetisk materiale kan disse restriktionsendonukleaser genkende specifikke nukleotidsekvenser. Således kan DNA, der ikke har denne sekvens, være uforstyrret inde i bakterien..

I modsætning hertil, når endonukleasen genkender restriktionsstedet, binder det sig til DNA'et og skærer det..

Biologer er interesserede i at studere det genetiske materiale af levende ting. DNA består imidlertid af flere millioner basepar i længden. Disse molekyler er ekstremt lange og skal analyseres i små fragmenter..

For at nå dette mål er restriktionsendonukleaser integreret i forskellige molekylærbiologiske protokoller. For eksempel kan et individuelt gen fanges og replikeres til fremtidig analyse. Denne proces kaldes "kloning" af et gen..

Restriktionsfragmentlængde polymorfisme (RFLP)

Restriktionsfragmentlængde-polymorfier henviser til mønsteret for specifikke nukleotidsekvenser i DNA, som restriktionsendonukleaser er i stand til at genkende og klippe.

Takket være enzymernes specificitet er hver organisme kendetegnet ved et specifikt mønster for skæring i DNA'et med oprindelsesfragment med variabel længde.

Typer af restriktionsendonukleaser

Historisk er restriktionsendonukleaser blevet klassificeret i tre typer enzymer, udpeget med romertal. På det seneste er en fjerde type endonuklease blevet beskrevet.

Type I

Det vigtigste kendetegn ved type I-endonukleaser er, at de er proteiner, der består af flere underenheder. Hver af disse fungerer som et enkelt proteinkompleks og har normalt to underenheder kaldet R, to M og en S.

S-delen er ansvarlig for genkendelsen af ​​restriktionsstedet i DNA. R-underenheden er på sin side essentiel for spaltning, og M er ansvarlig for at katalysere methyleringsreaktionen..

Der er fire underkategorier af type I-enzymer, der er kendt med bogstaverne A, B, C og D, der er i almindelig brug. Denne klassificering er baseret på genetisk komplementering.

Type I enzymer var de første restriktionsendonukleaser, der blev opdaget og oprenset. De mest nyttige i molekylærbiologi er imidlertid type II, som vil blive beskrevet i det næste afsnit..

Type II

Type II-restriktionsendonukleaser genkender specifikke DNA-sekvenser og spaltning i en konstant position nær en sekvens, der producerer 5'-phosphater og 3'-hydroxyler. De kræver generelt magnesiumioner (Mgto+), men der er nogle, der har meget mere specifikke krav.

Strukturelt kan de fremstå som monomerer, dimerer eller endda tetramerer. Rekombinant teknologi anvender type II-endonukleaser, og af denne grund er mere end 3.500 enzymer blevet karakteriseret.

Type III

Disse enzymsystemer består af to gener, kaldet mod Y bøf, den kode for de underenheder, der genkender DNA og for ændringer eller begrænsninger. Begge delbyer er nødvendige for begrænsning, en proces, der er fuldstændig afhængig af ATP-hydrolyse..

For at spalte DNA-molekylet skal enzymet interagere med to kopier af den ikke-palindromiske genkendelsessekvens, og stedene skal være i omvendt retning på substratet. Spaltning er forud for en DNA-translokation.

Type IV

En yderligere gruppe er blevet identificeret for nylig. Systemet består af to eller flere gener, der koder for proteiner, der kun spalter modificerede DNA-sekvenser, enten methyleret, hydroxymethyleret eller hydromethyleret glucosyl.

F.eks. Genkender enzymet EckKMcrBC to dinukleotider med den almene form RmC; en purin efterfulgt af et methyleret cytosin, som kan adskilles af flere basepar - fra 40 til næsten 3000. Spaltning finder sted omkring 30 basepar bag det sted, som enzymet genkender.

Type V endonukleaser

Endonukleaser af denne type er også kendt som endonukleaser "homing”. Disse enzymer genkender og klipper mål-DNA-sekvensen på unikke steder i genomet fra 14 til 40 bp.

Disse enzymer er ofte kodet i introner, og deres funktion menes at være at fremme vandret overførsel af de skårne sekvenser. Efter skæring opstår der en nedbrydningsreparation i DNA-dobbelthelixen baseret på den komplementære sekvens.

Eksempler

Endonuklease I af E coli det fungerer som et forsvarssystem mod fager og parasitter. Det er hovedsageligt placeret mellem den cytoplasmatiske membran og cellevæggen. Producerer dobbeltstrengede brud i det fremmede DNA, som det interagerer med i det periplasmiske rum.

CRISPR-Cas-endonukleaser er enzymer, der virker på forsvarsmekanismen for mange typer bakterier. Disse identificerer og klipper specifikke DNA-sekvenser fra invaderende organismer, som generelt er vira.

For nylig opdagede forskere fra Massachusetts Institute of Technology (MIT) CRISPR-Cas12bm genomredigeringssystemet med høj præcision til modifikation af humane celler.

Referencer

  1. Burrell, M. M. (red.). (1993). Enzymer af molekylærbiologi. Totowa, NJ: Humana Press.
  2. Loenen, W. A., Dryden, D. T., Raleigh, E. A., og Wilson, G. G. (2013). Type I restriktionsenzymer og deres slægtninge. Nukleinsyrer forskning42(1), 20-44.
  3. Murray, P. R., Rosenthal, K. S. og Pfaller, M. A. (2017). Medicinsk mikrobiologi + StudentConsult på spansk + StudentConsult. Elsevier Health Sciences.
  4. Nathans, D., & Smith, H. O. (1975). Restriktionsendonukleaser i analysen og omstrukturering af DNA-molekyler. Årlig gennemgang af biokemi44(1), 273-293.
  5. Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V., & Wende, W. (2005). Type II-restriktionsendonukleaser: struktur og mekanisme. Cellular og molekylær biovidenskab62(6), 685.

Endnu ingen kommentarer