Agar konto standard begrundelse, forberedelse og anvendelser

1159
Robert Johnston

Det agar standard tæller Det er et fast, ikke-selektivt dyrkningsmedium designet til kvantificering af den aerobe mikrobielle belastning, der findes i prøver af drikkevand, spildevand, mejeridrikke, blandt andre fødevarer. Dette medium er også kendt som PCA-agar for dets akronym i engelsk pladeantal. Det blev oprettet i 1953 af Buchbinder, Baris og Goldstein.

Standardtællingsagarmediet er sammensat af gærekstrakt, triptein, glucose, agar og destilleret vand. Denne formulering indeholder basale ernæringselementer, der tillader udvikling af den nuværende aerobe mikrobielle belastning, ikke krævende.

Decimalfortyndinger til optælling af CFU'er i standardtællinger. Kilde: Quentin Geissmann [CC BY-SA 3.0 (https://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0)]

Da mediet ikke indeholder hæmmere, kan bakterier vokse uden nogen begrænsninger, hvilket gør det ideelt til generel kolonitælling. Imidlertid vil pladekvantificeringsteknikken ikke detektere alle de tilstedeværende bakterier, men kun dem, der er i stand til at vokse under de miljømæssige forhold, som den podede standardtællingsagar udsættes for..

I denne forstand søger pladekvantificeringsteknikken generelt at bestemme mængden af ​​bakterier af den aerobe mesofile type, det vil sige dem, der udvikler sig ved temperaturer mellem 25 og 40 ° C, med en optimal væksttemperatur på 37 ° C..

Denne bakteriegruppe er meget vigtig, fordi de fleste af de patogene bakterier for mennesker findes der..

Det skal bemærkes, at det undertiden kan være af interesse at kvantificere mængden af ​​psykrofile bakterier, der er til stede i mad. Disse bakterier er dem, der udvikler sig ved lave temperaturer (< 20°C) y son las responsables de que los alimentos se descompongan más rápido, aun estando en nevera.

Ligeledes kan termofile bakterier, som udvikler sig i et område mellem 50 ° C og 80 ° C eller mere, være vigtige i visse typer fødevarer, såsom dåse fødevarer..

Mikrobiel kvantificering udtrykkes i kolonidannende enheder (CFU) pr. Gram eller milliliter prøve.

Artikelindeks

  • 1 begrundelse
  • 2 Forberedelse
    • 2.1 Til hældepladeteknikken
    • 2.2 Til såning på overfladen
  • 3 Brug
    • 3.1 Pladehældningsteknik (dybdesåning)
    • 3.2 Teknik til såning af overflade
  • 4 Kvalitetskontrol
  • 5 Begrænsninger
  • 6 Referencer

Basis

Standardtællingsmediet er designet til at muliggøre en vellykket vækst af ikke-krævende aerobe bakterier, da gærekstraktet, triptein og glucose tilvejebringer de nødvendige næringsstoffer til god mikrobiel vækst..

På den anden side har mediet en lys farve og et gennemsigtigt udseende, hvorfor det er ideelt til visualisering af kolonier udviklet ved dybsåningsmetoden (pladehældning)..

Kolonitælling ved Drigalski-spateloversåningsmetoden er også mulig..

Når den mikrobielle belastning er høj, skal der foretages decimale fortyndinger af den undersøgte prøve for at kunne tælle CFU'erne.

Det skal bemærkes, at dette medium anbefales af American Public Health Association (APHA) til optælling af aerobe mesofiler..

Forberedelse

Vej 23,5 g af det dehydratiserede medium og opløses i en liter destilleret vand. For at opløses fuldstændigt skal blandingen opvarmes ved omrøring ofte, indtil den koger. De næste trin afhænger af såningsteknikken, der skal bruges.

Til hældepladeteknikken

Fordel ved at dispensere 12 til 15 ml i reagensglas. Derefter steriliseres i en autoklave ved 121 ° C i 15 minutter. Tillad at størkne lodret i form af en blok. Opbevares i køleskab indtil brug.

Smelt stikket, når du skal bruge det. Når det er smeltet, skal det opbevares i et vandbad ved 44-47 ° C, mens prøverne fremstilles..

Til overfladesåning

Steriliser mediet i en autoklav ved 121 ° C og fordel derefter 20 ml i sterile petriskåle. Lad størkne, vende om og opbevare i køleskab indtil brug.

Temperer plader inden brug. Mediets pH skal være 7,0 ± 0,2.

Brug

Standard Count Agar bruges i den aerobe mesofiltællingsteknik under mikrobiologisk analyse af vand og mad. Antallet af aerobe mesofiler er nødvendigt, da det bestemmer den hygiejniske kvalitet af den undersøgte prøve..

Anvendelsen af ​​denne teknik (ved hjælp af dette medium) tillader makroskopisk visualisering af isolerede kolonier til deres kvantificering..

Pladehældningsteknik (dybdesåning)

-Behandle

Teknikken består af følgende:

1) Homogeniser prøven for at omfordele de tilstedeværende bakterier.

2) En initial suspension fremstilles i en steril flaske eller pose, idet forholdet mellem 10 g eller 10 ml prøve respekteres i 90 ml fortyndingsmiddel (10-1).

3) Fra den oprindelige suspension foretages de relevante decimale fortyndinger afhængigt af prøvetypen. Eks: (10-to, 10-3, 10-4). Fortyndinger foretages med peptonvand eller fosfatbuffer..

For at gøre dette skal du tage 1 ml af den oprindelige suspension og placere den i 9 ml fortyndingsmiddel, fortsætte fortyndingerne, hvis det er nødvendigt, og tag nu 1 ml af fortyndingen 10-to og så videre.

4) Tag 1 ml af hver fortynding og anbring i tomme sterile petriskåle.

5) Tilsæt til hver plade 12 til 15 ml standardtællingsagar, der tidligere var smeltet og afgjort ved 44 - 47 ° C.

6) Drej forsigtigt pladerne for at fordele prøven jævnt over agar og lad den størkne..

7) Vend pladerne og inkuberes ved 37 ° C i aerobiose i 24 til 48 timer.

8) I slutningen af ​​tiden undersøges pladerne, og kolonierne tælles i den fortynding, der tillader det. Disse plader, der har mellem 30 og 300 CFU, vælges til optællingen.

Tælling kan udføres manuelt, eller du kan bruge kolonitællerudstyret.

De tilladte værdier pr. Ml prøve kan variere fra land til land afhængigt af de regler, de er underlagt..

-Beregning af CFU

Den generelle beregning udføres ved hjælp af følgende formel:

Formel til den generelle beregning af kvantificering af CFU'er. Kilde: National Administration of Medicines, Food and Medical Technology (ANMAT). Mikrobiologisk analyse af fødevarer, officiel analytisk metode, indikatormikroorganismer. 2014 bind 3. Findes på: anmat.gov.ar

Udtryk resultaterne i 1 eller 2 cifre ganget med den relevante base 10. Eksempel: hvis resultatet er 16.545, afrundes det baseret på det tredje ciffer til 17.000, og det udtrykkes som følger: 1,7 x 104. Hvis resultatet nu var 16.436, afrund det til 16.000 og udtryk 1,6 x 104.

Overfladsåningsteknik

-Behandle

-Inokuler med 0,1 ml af den direkte prøve, hvis den er flydende, initial suspension 10-1 eller 10 fortløbende fortyndinger-to, 10-3 osv. i midten af ​​en standard tæller agarplade.

-Fordel prøven jævnt med en Drigalski-spatel eller en L-formet glasstang, lad den stå i 10 minutter.

-Vend pladerne og inkuberes aerobt ved 37 ° C i 24 til 48 timer.

-Fortsæt med at tælle kolonierne, vælg de plader, der er i området mellem 20 - 250 CFU.

-Beregning af CFU

Til beregningen anvendes fortyndingsfaktoren, som er den inverse. Antallet afrundes til 2 signifikante cifre (afrunding efter det tredje ciffer) og udtrykkes i styrke af base 10. For eksempel tælles 224 CFU i prøven uden fortynding (10-1), 22 x 10 er rapporteret1  UFC, men hvis tallet var 225, rapporteres det 23 x 101 UFC.

Hvis du nu tæller 199 CFU i fortynding 10-3, vil blive rapporteret 20 x 104 CFU, men hvis 153 CFU tælles i den samme fortynding, rapporteres 15 x 104 UFC.

QA

Standardtællingsdyrkningsmediet kan evalueres ved hjælp af certificerede kendte stammer, såsom: Escherichia coli ATCC 8739, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Bacillus subtilis ATCC 6633, Lactobacillus fermentum ATCC 9338, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Shigella flexneri ATCC 12022.

Hvis dyrkningsmediet er under optimale forhold, forventes tilfredsstillende vækst i alle tilfælde undtagen L. fermentum som kan have en regelmæssig optræden.

For at evaluere steriliteten af ​​dyrkningsmediet skal en eller to plader af hver klargjort batch (uden podning) inkuberes ved 37 ° C i aerobiose i 24 timer. Efter denne tid skal der ikke observeres nogen vækst eller farveændring af mediet..

Begrænsninger

-Smelt ikke agaren mere end én gang.

-Det tilberedte medium kan vare op til 3 måneder, så længe det opbevares i køleskab og beskyttes mod lys..

-Dette medium er ikke egnet til krævende eller anaerobe mikroorganismer.

Referencer

  1. National Administration of Medicines, Food and Medical Technology (ANMAT). Mikrobiologisk analyse af fødevarer, officiel analytisk metode, indikatormikroorganismer. 2014 bind 3. Findes på: anmat.gov.ar
  2. Laboratorios Difco Francisco Soria Melguizo, S.A. Pladetæller Agar. 2009. Tilgængelig på: http://f-soria.es
  3. Conda Pronadisa Laboratories. Standard Method Agar (PCA) i henhold til APHA og ISO 4833. Tilgængelig på: condalab.com
  4. Britannia Laboratories. Agarpladetælling. 2015.Tilgængelig på: britanialab.com
  5. Camacho A, Giles M, Ortegón A, Palao M, Serrano B og Velázquez O. 2009. Teknikker til mikrobiologisk analyse af fødevarer. 2. udgave Det kemiske fakultet, UNAM. Mexico. Fås på: depa.fquim.unam

Endnu ingen kommentarer