Det DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindol) Det er et farvestof, der på grund af dets fluorescerende egenskab tjener som en markør, der blandt andet er meget anvendt i fluorescensmikroskopi eller flowcytometri-teknik. Den fluorescens, den udsender, er lyseblå, dens excitation finder sted mellem 455-461 nm (UV-lys).
DAPI-farvestof kan passere gennem døde cellers cellemembran med stor lethed. Det kan også plette kernerne i levende celler, men i dette tilfælde skal koncentrationen af dette være højere.
Farvestoffet er i stand til at få adgang til cellulært DNA, for hvilket det har en særlig affinitet, der binder med stor iver til de nitrogenholdige baser adenin og thymin. Af denne grund er det meget nyttigt i nogle molekylærbiologiske teknikker..
Denne forbindelse hører til gruppen af indolfarvestoffer og har vist sig at have større følsomhed over for DNA end ethidiumbromid og propidiumiodid, især på agarosegeler..
Anvendelsen af dette fluorescerende farvestof er meget bred, da det er nyttigt til: at studere ændringer i DNA i apoptotiske processer (celledød) og derfor detektere celler i denne proces; til DNA-fotofotprintning (DNA-fotoudskrivning); at studere bakteriel forurening eller at visualisere nuklear segmentering.
Det er også blevet brugt i undersøgelsen af kromosomale bånd til påvisning af DNA fra Mycoplasmas sp, i DNA-protein-interaktion, i farvning og optælling af celler ved immunfluorescens og endda at farve modne pollenkorn.
Artikelindeks
DAPI er en forkortelse for dets kemiske navn (4 ', 6-diamidino-2-phenylindol). Dens molekylformel er C16HfemtenN5. Det har en molekylvægt på 350,3. I nærheden af UV-lysområdet (345 til 358 nm) forekommer den maksimale excitation af DAPI-DNA-komplekset, mens den maksimale fluorescensemission finder sted mellem 455-461 nm..
Dette farvestof er karakteriseret ved at være et gult pulver, men de strukturer, der er markeret med denne fluorofor, udsender et lyseblåt lys..
Det er en forbindelse, der er opløselig i vand, men for at fremskynde dets opløsning kan der påføres noget varme. Det kan fortyndes med PBS, men ikke opløses direkte i det..
Når farvestoffet er klargjort, skal det opbevares i mørke, dvs. beskyttet mod lys, ved en temperatur på 2 til 8 ° C (køleskab). Under disse betingelser er farvestoffet stabilt i mere end 3 uger eller måneder..
Hvis den er beskyttet mod lys, men efterlades ved stuetemperatur, falder dens stabilitet til 2 eller 3 uger, men udsættes for direkte lys er forringelsen meget hurtig. Hvis du vil opbevare meget længere, kan den afkøles ved -20 ° C fordelt i alikvoter.
Denne farvning er baseret på at generere en nuklear modfarve i de vigtigste molekylærbiologiske teknikker, såsom: flowcytometri, fluorescensmikroskopi og farvning af metafasekromosomer eller mellemfasekerner, blandt andre..
Denne teknik er baseret på den store affinitet, som farvestoffet har for de nitrogenholdige baser (adenin og thymin) indeholdt i det genetiske materiale (DNA) i den mindre rille. Mens det på det cytoplasmatiske niveau efterlader meget lidt baggrund.
Når det fluorescerende farvestof binder til adenin- og thyminregionerne i DNA, stiger fluorescensen markant (20 gange mere). Den farve, den udsender, er lyseblå. Især er der ingen fluorescensemission, når der bindes til GC (guanin-cytosin) basepar.
Det er vigtigt at bemærke, at selvom det også har en affinitet for RNA, forårsager dette ikke et problem, fordi den højeste grad af energiemission fra dette molekyle forekommer ved en anden bølgelængde (500 nm), i modsætning til DNA, som gør det ved 460 nm . Derudover er stigningen i fluorescens, når den først er bundet til RNA, kun 20%..
DAPI bruges mere til at plette døde (fikserede) celler end levende celler, da der er behov for en meget højere koncentration af farvestoffet for at plette sidstnævnte, det er fordi cellemembranen er meget mindre permeabel for DAPI, når den er i live.
DAPI-plet kan bruges i kombination med røde og grønne fluoroforer til en flerfarvet oplevelse.
DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindol) er en fremragende fluorofor og anvendes derfor i vid udstrækning i forskellige teknikker og til forskellige formål. Brug af DAPI i de vigtigste teknikker forklares nedenfor.
Forskerne Gohde, Schumann og Zante i 1978 var de første til at bruge og foreslå DAPI som en fluorofor i flowcytometri-teknikken, idet de havde stor succes på grund af dens høje følsomhed over for DNA og dens høje intensitet i fluorescensemission..
Brugen af DAPI i denne teknik muliggør undersøgelse af cellecyklussen, kvantificering af celler og farvning af levende og døde celler..
Selvom der er andre farvestoffer, såsom ethidiumbromid, Hoechst-oxid, acridinorange og propidiumiodid, er DAPI en af de mest anvendte, fordi den er mere fotostabil end de tidligere nævnte..
Til denne teknik er det nødvendigt at fiksere cellerne, for dette kan absolut ethanol eller 4% paraformaldehyd anvendes. Prøven centrifugeres, og supernatanten kasseres, hvorefter cellerne hydratiseres ved tilsætning af 5 ml PBS-buffer i 15 minutter..
Mens tiden går, forbered DAPI-pletten med en farvningsbuffer (FOXP3 fra BioLegend) i en koncentration på 3 µM.
Præparatet centrifugeres, supernatanten kasseres og dækkes derefter med 1 ml DAPI-opløsning i 15 minutter ved stuetemperatur..
Tag prøven til flowcytometeret med den relevante laser.
En anden teknik, hvor DAPI anvendes, er i mikrofluorometri med flow sammen med en anden fluorofor kaldet mithramycin. Begge er nyttige til kvantificering af chloroplast-DNA individuelt, men DAPI er bedst egnet til måling af T4-bakteriofagpartikler..
Denne teknik bruger grundlæggende DNA-prober mærket med et fluorescerende farvestof, der kan være DAPI..
Prøven kræver varmebehandling for at denaturere det dobbeltstrengede DNA og konvertere det til to enkeltstrengede tråde. Derefter hybridiseres den med en denatureret DNA-probe mærket med DAPI, der har en sekvens af interesse..
Senere vaskes det for at eliminere det, der ikke hybridiserede, en kontrast bruges til at visualisere DNA'et. Fluorescensmikroskopet tillader observation af den hybridiserede probe.
Denne teknik har til formål at detektere specifikke sekvenser i det kromosomale DNA og være i stand til at stille diagnosen for visse sygdomme.
Disse cytomolekylære teknikker har været til stor hjælp med at bestemme detaljer i studiet af karyotyper. For eksempel har det vist regionerne rige på adenosin- og thyminbasepar kaldet heterochromatiske regioner eller DAPI-bånd..
Denne teknik bruges i vid udstrækning til undersøgelse af kromosomer og kromatin hos planter og dyr såvel som til diagnosticering af prænatal og hæmatologisk patologi hos mennesker..
I denne teknik er den anbefalede DAPI-koncentration 150 ng / ml i en periode på 15 minutter..
Samlede dias skal opbevares beskyttet mod lys ved 2-8 ° C.
Celler fikseres med 4% paraformaldehyd. Hvis der skal anvendes andre pletter, efterlades DAPI i slutningen som en modfarve, og cellerne dækkes med PBS-opløsning i 15 minutter. Mens tiden går, skal du forberede DAPI-opløsningen ved at fortynde den med PBS, så den endelige koncentration er 300 µM.
Derefter fjernes det overskydende PBS og dækkes med DAPI i 5 minutter. Det vaskes flere gange. Diaset observeres i et fluorescensmikroskop under det passende filter.
Denne forbindelse skal håndteres med forsigtighed, fordi det er en forbindelse, der har mutagene egenskaber. Aktivt kul bruges til at fjerne denne forbindelse fra vandige opløsninger, der skal kasseres..
Handsker, kjole og sikkerhedsbriller skal bruges til at undgå ulykker med dette reagens. Hvis der opstår kontakt med hud eller slimhinde, skal området vaskes med nok vand.
Du bør aldrig pipettere dette reagens gennem munden, brug pipetter.
Foruren ikke reagenset med mikrobielle midler, da dette vil føre til fejlagtige resultater.
Fortynd ikke DAPI-pletten mere end anbefalet, da dette vil reducere farvningens kvalitet markant..
Udsæt ikke reagenset for direkte lys, eller hold det varmt, da dette reducerer fluorescens.
Endnu ingen kommentarer