Det Löwenstein-Jensen medium er et selektivt fast medium til isolering og udvikling af bakterier af slægten Mycobacterium, såsom Mycobacterium tuberculosis, M. avium, blandt andre med undtagelse af de spedalske arter, som ikke kan dyrkes.
Bakterier af slægten Mycobacterium vokser ikke i konventionelle dyrkningsmedier, derfor var det nødvendigt at designe et specielt medium til deres isolering. Det originale medium blev oprettet af Löwenstein og senere modificeret af Jensen.
Ændringen bestod i eliminering af Congo-rødfarvestof, der erstattede det med en højere koncentration af malakitgrønt. Det ændrede også koncentrationerne af magnesiumcitrat og monokaliumphosphat.
Löwenstein-Jensen-medium indeholder i øjeblikket kartoffelstivelse, asparagin, magnesiumcitrat, monokaliumphosphat, magnesiumsulfat, malakitgrøn, nalidixinsyre, cycloheximid, lincomycin, pisket æg, glycerin og vand..
Mykobakterier isoleres normalt fra steder, der ikke er sterile, såsom sputum, urin, abscesser, blandt andre. Dette betyder, at de fleste af prøverne indeholder den sædvanlige mikrobiota i området plus patogenet..
Derfor indeholder Löwenstein-Jensen-mediet en række hæmmere i dets sammensætning repræsenteret af malakitgrøn, antibiotika og svampedræbende midler..
Derudover skal prøver, der kommer fra ikke-sterile steder, dekontamineres og neutraliseres, før de podes på Löwenstein-Jensen-medium.
Artikelindeks
Tilstedeværelsen af æg og glycerin i Löwenstein-Jensen-mediet stimulerer væksten af mycobakterier, fordi de tilvejebringer de fedtsyrer og proteiner, der er nødvendige for udviklingen af disse mikroorganismer..
Löwenstein-Jensen-medium indeholder malakitgrøn, som er en hæmmer af den ledsagende mikrobiota. Men den indeholder også nalidixinsyre (35 µg / ml), som hæmmer den gramnegative mikrobiota, cycloheximid (400 µg / ml), som hæmmer saprofytiske svampe og gær, og lincomycin (2 µg / ml), som hæmmer den grampositive mikrobiota.
Nogle kommercielle virksomheder foretrækker at tilføje følgende kombination af antibiotika: polymyxin B 200.000 enheder / L, amphotericin B 10 mg / L, carbenicillin 50 mg / L og trimethoprim 10 mg / L.
Dette medium indeholder ikke agar, hvorfor størkning af mediet sker på grund af koagulationen af albuminet, der er til stede i ægget under sterilisering..
Vej 37,3 g af det dehydratiserede medium i 600 ml destilleret vand, hvortil der tidligere er tilsat 12 ml glycerol. Blandingen opvarmes under omrøring ofte indtil den er helt opløst. Autoklaver mediet ved 121 ° C i 15 minutter.
På den anden side skal en homogen suspension af 1000 ml friske æg fremstilles under aseptiske forhold. Tilsæt ægsuspensionen til 600 ml tilberedt medium ved en temperatur på 50 - 60 ° C, undgå luftbobler.
Antibiotiske opløsninger tilsættes også efter autoklavering..
Hæld mediet i sterile reagensglas med skruelåg. Varm rørene ved 85 ° C i 45 minutter i en skråt stilling..
Farven på det fremstillede medium er akvamaringrøn og kan udgøre hvidlige pletter på grund af tilstedeværelsen af æglipider..
Mediets pH skal være 7,2 ± 0,2
Opbevar rørene i køleskab og beskyttet mod direkte lys indtil brug. Temperér før såning.
Der er en modifikation af mediet kaldet "Gruft modification of the Löwenstein Jensen". Dette indeholder de samme forbindelser som det klassiske medium, men der tilsættes RNA-5 mg / 100 ml, og som hæmmere indeholder det malachitgrønt 0,025 g / 100 ml, penicillin 50 U / ml og nalidixinsyre 35 ug / ml..
Löwenstein-Jensen-medium anvendes til isolering af mycobakterier fra forskellige typer prøver. En Ziehl-Neelsen-plet anbefales til enhver prøve, hvor der er mistanke om tilstedeværelsen af mycobakterier..
Nogle prøver kommer fra sterile steder, men andre ikke. Ikke-sterile prøver skal dekontamineres efter behov:
Sputumprøver skal dekontamineres som følger: bestemm mængden af sputumprøve i ml og tilsæt den samme mængde 4% NaOH til prøven og inkuberes ved 37 ° C.
Ryst blandingen ofte over en periode på 30 minutter. Derefter centrifugeres ved 3000 RPM i 30 minutter.
Supernatanten kasseres over en phenolisk desinfektionsmiddelopløsning. Brug sedimentet til såning, men først skal pH neutraliseres.
For at neutralisere sedimentet, HtoSW4 5% i nærværelse af den fenolrøde indikator, indtil den når en neutral pH, der producerer en laksefarve.
I dette tilfælde skal prøven centrifugeres ved 3000 RPM i 30 minutter. Supernatanten kasseres, og pelleten anvendes. For at dekontaminere sedimentet tilsættes 3 ml 4% NaOH og omrøres ofte ved 37 ° C i en periode på en halv time..
Centrifugeres igen, supernatanten kasseres, og pelleten anvendes. Sidstnævnte skal neutraliseres som forklaret i blodprøven..
Lad prøven sætte sig i køleskabet i 24 timer. Adskil supernatanten. Den resterende pellet skal centrifugeres i 30 minutter ved 3000 RMP. Supernatanten kasseres igen og rekonstitueres med 3 ml steril fysiologisk opløsning..
Tilsæt 3 ml 4% NaOH og fortsæt til dekontaminering og neutralisering som beskrevet ovenfor..
I denne type prøve centrifugeres den, og supernatanten kasseres. Udfør et gram på sedimentet eller observer det direkte under mikroskopet; Hvis der ikke observeres bakterier, er dekontamineringstrinet ikke nødvendigt, heller ikke neutraliseringstrinet.
I dette tilfælde kan prøven sås direkte ved hjælp af sedimentet. Hvis der er bakterier, skal du fortsætte med at dekontaminere og neutralisere som beskrevet ovenfor..
Til denne type prøve skal der tilsættes 5 ml destilleret vand til senere centrifugering ved 1500 RPM i 10 minutter. Supernatanten kasseres og centrifugeres igen ved 3500 RPM i 30 minutter. Brug sedimentet til at så dyrkningsmediet.
Pinden skal placeres i et sterilt rør indeholdende lige dele destilleret vand og 4% NaOH. Pinden skal presses mod rørets vægge, så prøven fortyndes i væsken. Centrifuger og brug sedimentet. Neutraliser sedimentet som allerede beskrevet.
Löwenstein-Jensen-mediet inokuleres ved tilsætning af 0,5 ml af prøven på overfladen af mediet. Drej røret for at fordele prøven gennem mediet. Brug ikke platinahåndtag.
Et andet rør kan sås indeholdende Stonebrink-medium med henblik på isolering Mycobacterium bovis og andre arter, der ikke vokser i Löwenstein-Jensen-mediet.
De podede rør inkuberes aerobt ved 37 ° C, med hætten let løs og skrånende ca. 5 ° og beskyttet mod lys. Miljøet kan beriges med 5-10% kuldioxid. Kontroller kulturer to gange om ugen, indtil kolonier vises.
Når prøven er absorberet, strammes hætterne. Den maksimale inkubationstid er 8 uger, hvis der efter dette tidspunkt ikke er nogen vækst, rapporteres den som negativ.
Følgende stammer kan bruges som kvalitetskontrol:
Mycobacterium tuberculosis ATCC 27294, Mycobacterium kansasii ATCC 12478, Mycobacterium avium ATCC 19291, Mycobacterium bovis ATCC 19219, Mycobacterium fortuitum ATCC 6841, Escherichia coli ATCC 25922, Streptococcus pyogenes ATCC 19615, Cryptococcus neoformans ATCC 32045
Der forventes fremragende udvikling for de første tre nævnte arter for M. fortuitum vækst skal være god, mens det for M. bovis der forventes lidt eller ingen vækst. Mens andre arter end slægten Mycobacterium skal hæmmes fuldt ud.
Det forberedte medium skal beskyttes mod lys, langvarig eksponering for lys får mediet til at blive fra grønt til blåt, i dette tilfælde kan mediet ikke længere bruges. Dette skyldes, at malakitgrøn er lysfølsom..
Mediet, da det indeholder æg, kan let forurenes, hvis det ikke håndteres aseptisk. Kan opløses, hvis de er forurenet med proteolytiske bakterier.
Dyrkning og håndtering af bakterier af slægten Mycobacterium kræver kvalificeret personale, der er opmærksom på de biosikkerhedsforanstaltninger, der skal følges for at undgå at blive forurenet eller forurene andre..
HCI bør ikke anvendes i neutraliseringstrinnet på grund af dannelsen af natriumchlorid, som kan være giftigt for Kochs bacillus..
Prøver skal opbevares nedkølet og beskyttes mod lys, mens de ikke behandles..
Endnu ingen kommentarer