Det koagulasetest det er en laboratorieteknik, der bruges til at afsløre tilstedeværelsen af koagulaseenzymet. Dette enzym har den egenskab, at det koagulerer plasma. Loeb i 1903 var den første til at beskrive dette enzym.
Denne test udføres på Gram-positive kokker, katalase-positive, hvilket gør det muligt at skelne mellem stammerne af Staphylococcus aureus fra resten af stafylokokker, da det er den eneste mikroorganisme af klinisk betydning, der producerer den.
I denne forstand kaldes medlemmer af Staphylococaceae-familien, der tester negativt, ofte som koagulase-negativ Staphylococcus..
Der er nogle forskellige stammer til S. aureus der kan producere koagulase, såsom Staphylococcus schleiferi spp coagulans, S. hyicus, S. intermedius og S. delphini.
De første tre er imidlertid af klinisk betydning på veterinærniveau og kunne meget sjældent findes som et forårsagende middel til infektioner hos mennesker, mens S. delphini det findes kun i havmiljøer.
Desuden er de let differentierede, fordi S. hyicus Y S. intermedius gær ikke mannitol og S. schleiferi spp koagulaner gærer ikke maltose eller trehalose, mens S. aureus gærer disse kulhydrater.
Tilstedeværelsen af koagulaseenzymet har været forbundet med virulensen af stammerne. Denne teori har imidlertid været ved at falde fra hinanden i betragtning af, at der observeres andre virulente koagulase-negative arter, der er i stand til at producere vigtige infektioner..
Artikelindeks
Staphylococcus aureus producerer to typer koagulase, en der forbliver bundet til cellevæggen, også kaldet agglutinationsfaktor eller reaktiv koagulasefaktor (CRF), og en ekstracellulær, der frigives i flydende kulturer. Derfor kaldes de henholdsvis bundet koagulase og fri koagulase..
Koagulaseenzymet skylder sit navn til den handling, det producerer. Dette har evnen til at transformere fibrinogen til fibrin, hvilket skaber en tydelig koagel, når den findes i plasma, det vil sige dette enzym simulerer aktiviteten af thrombin i koagulationskaskaden.
Faktisk er en af de mest accepterede teorier, at bundet koagulase reagerer med fri koagulase for at aktivere koagulationsfaktorer. Denne aktivering genererer et stof, der virker på samme måde som protrombin, hvilket skaber en forbindelse med funktionen af thrombin..
Forskellen med den normale koagulationskaskade er, at denne reaktion ikke kræver tilstedeværelse af calcium og ikke påvirkes af heparin.
For at udføre koagulasetesten er det nok at stå over for en frisk kultur af Staphylococcus med et fortrinsvis kaninplasma og således observere dannelsen af blodproppen.
Der er specifikke teknikker til at detektere bundet koagulase og bundet og fri koagulase på samme tid..
Nogle stammer af S. aureus de giver et positivt resultat hurtigere end andre. Hastigheden af koageldannelse er direkte proportional med koncentrationen af koagulase til stede..
Slide-koagulasetesten detekterer bundet koagulase, og rørtesten detekterer både bundet og fri koagulase.
-Rengør objektglasset
-Kaninplasma kan fortrinsvis også anvendes humant eller hesteplasma. Plasma kan købes kommercielt lyofiliseret og rekonstitueres til brug, eller det kan bruges frisk (frisk). Et andet levedygtigt alternativ er brugen af fibrinogen.
-Steril saltvand (0,85%) (SSF).
Tegn venøst blod fra mennesker eller dyr. Et hvilket som helst af de følgende antikoagulantia kan anvendes: EDTA, calciumoxalat, heparin eller natriumcitrat. Bland godt og centrifuger. Fjern supernatanten (plasma) aseptisk uden røde blodlegemer og placer den i et sterilt rør.
Rekonstituer som angivet på hætteglasset med kommercielt kit.
Brug citreret plasma til at blande plasmaet i lige store dele med en mættet natriumchloridopløsning. Tillad udfældning og centrifugering.
Kassér supernatanten, rekonstituer bundfaldet op til 5 gange dets volumen med sterilt destilleret vand. Tilsæt 5 enheder heparin for hver ml fibrinogen. Opbevares i et sterilt rør.
En dråbe saltvand og en dråbe plasma placeres separat på et objektglas. Tag med platinsløjfen 1 eller 2 rene kolonier af den mikroorganisme, der skal testes.
Bland bakteriebelastningen i plasmadråben og gentag operationen på SSF-dråben. Overhold resultaterne med det samme. Et positivt resultat vil være et, hvor dannelsen af et makroskopisk agglutinat (hvidt bundfald) observeres efter et minut på siden af dråben med plasma.
SSF-faldet fungerer som en negativ kontrol. Hvis der observeres agglutination med SSF, betyder det, at mikroorganismen selvagglutinerer, hvilket kan give falske positive resultater. I dette tilfælde skal det bekræftes med rørprøven.
Det anbefales også at montere en positiv kontrol med en kendt stamme af S. aureus.
Agglutination inden for 5-20 sek (stærk positiv test).
Variabel agglutination mellem 20 sekunder og et minut (forsinket positiv test).
En vis grad af agglutination efter et minut (tvivlsom bevis). Det anbefales at gentage testen eller bekræfte ved hjælp af rørmetoden.
Ingen agglutination (negativ test).
Resultat med SSF. Det skal altid give negativt, hvis det automatisk giver positivt, bliver testresultatet ugyldigt.
-Sterilt reagensglas
-Plasma
-Vandbad ved 37 ° C.
Pipetter 0,5 ml plasma i et 12 x 75 reagensglas med en steril pipette. Læg platin løkken med 2 til 4 rene kolonier for at studere fra en fast kultur i 18 til 24 timer og opløs i plasma blandes forsigtigt og inkuberes ved 37 ° C i 4 timer.
Undersøg røret i den første time uden at ryste det, bare vip det forsigtigt. Hvis en blodprop stadig ikke ses, kan den observeres hvert 30. minut, indtil de 4 timer er afsluttet. Hvis det stadig er negativt efter 4 timer, kan det stå i op til 24 timer, men ved stuetemperatur. Overhold og rapporter resultatet.
Baseret på erfaring anbefaler nogle mikrobiologer at bruge 500 µl af en bakteriesuspension fra en 18-timers kultur i flydende medium til at udføre testen..
Det ser ud til at tilbyde hurtigere og mere pålidelige resultater end ved emulgering af kolonier fra faste medier, især hvis humant plasma opnået fra blodbanken er blevet brugt..
Anvendelsen af stammer fra en bouillon hjælper med at fortynde den mulige tilstedeværelse af humane antistylokokantistoffer i plasmaet, der kan hæmme virkningen af koagulase..
Hvis der ses en koagel, der omfatter hele væsken (fuldstændig koagulation) eller koagulerer uden noget i den resterende væske (delvis koagulering), skal det betragtes som en positiv test..
Hvis der ikke dannes koagel, dvs. suspensionen forbliver homogen, er testen negativ.
Fibrinogen bruges på samme måde som plasma og bruges til både dias- og tubetest. Fortsæt som beskrevet for plasma og fortolk på samme måde.
Det bruges til at differentiere Staphylococcus aureus af koagulase-negative stafylokokker.
Har friske kulturer af en stamme af S. aureus skal bruges som en positiv kontrol. En stamme af S. epidermidis som negativ kontrol.
-En positiv test bør ikke efterlades i inkubation i 24 timer, da den S. aureus producerer et fibrinolysin, der opløser blodproppen.
-Til en pålidelig test skal der anvendes frisk eller nyrekonstitueret plasma, ligesom det er vigtigt at bruge friske bakteriekulturer (18 til 24 timer). Dette undgår falske negativer.
-Testen skal udføres i forbindelse med en negativ og en positiv kontrol.
-Nogle faste medier kan interferere med koagulasetesten. Det anbefales ikke at bruge kolonier fra salt mannitolagar.
-Hvis citratplasma anvendes, anbefales det at placere 5 enheder heparin pr. Ml plasma for at undgå falske positive. Dette skyldes, at andre mikroorganismer end S. aureus de kan nedbryde citrat og få plasma til at størkne. I dette tilfælde anbefales det at lave en Gram og en katalasetest..
-Det er vigtigt i rørprøven at overvåge reaktionen hvert 30. minut, da der er stammer af S. aureus De producerer høje koncentrationer af fibrinolysin og vil fortynde den nydannede koagel hurtigt. Undgå falske negativer.
-Undgå at ryste røret skarpt, når du overvåger testen, dette kan ødelægge initieringen af koageldannelse, der ikke vil blive gendannet senere, hvilket kan forårsage falske negativer.
Endnu ingen kommentarer