Det Rekombinant DNA (RDNA eller rDNA) er et kunstigt nukleinsyremolekyle, der er oprettet i laboratoriet ved at integrere segmenter af interesse fra to organismer. Det er også kendt som kimærisk DNA takket være dets hybridegenskab. Denne type DNA findes ikke i naturen.
Den grundlæggende metode til at generere den inkluderer: (a) udvælgelse af et mål-DNA og dets indsættelse i et andet DNA-fragment (generelt et bakterieplasmid); (b) introduktion af dette plasmid i en bakterie, (c) selektion af bakterierne ved hjælp af antibiotika og endelig (d) ekspressionen af genet.
Teknikken udnytter et sæt enzymer, der gør det muligt at kopiere og indsætte specifikke DNA-fragmenter i henhold til forskerens vurdering..
Målet med rekombinant teknologi er i de fleste tilfælde ekspressionen af et protein (kendt som et rekombinant protein), der ønskes af molekylærbiologen til fremtidig forskning eller at skabe et protein med kommerciel og terapeutisk værdi - såsom humant insulin, for eksempel.
Artikelindeks
Alle organiske væsener, som vi kender, har flere egenskaber. En af disse er arten af det genetiske materiale og den måde, hvorpå proteiner produceres - en proces kendt som det centrale "dogme" inden for molekylærbiologi..
Med undtagelse af et par vira lagrer alle organismer genetisk information i DNA (deoxyribonukleinsyre), samlet på en meget kompakt og organiseret måde i cellekernen..
Til genekspression transkriberes DNA-molekylet til messenger-RNA, og sidstnævnte oversættes til aminosyrens sprog, byggestenene til proteiner..
Mellem 70'erne og 80'erne begyndte molekylærbiologer at drage fordel af de processer, der naturligt forekommer inde i cellen og var i stand til at ekstrapolere dem til laboratoriet..
På denne måde kunne et gen af animalsk oprindelse (f.eks. Et hvirveldyr) indsættes i et DNA-segment fra en bakterie; eller DNA fra en bakterie kunne kombineres med et viralt DNA. Således kan vi definere et rekombinant DNA som et molekyle sammensat af DNA fra to forskellige organismer..
Når dette hybrid eller rekombinante molekyle er skabt, udtrykkes genet af interesse. Med ordet udtryk vi vil henvise til processen med translation til protein.
Et nøgleelement i udviklingen af rekombinant DNA-teknologi var opdagelsen af restriktionsenzymer..
Disse er proteinmolekyler, der udviser evnen til at spalte DNA (nukleaser) i specifikke sekvenser, der tjener som "molekylær saks". De fragmenter, der genereres af disse enzymer, kaldes restriktionsfragmenter.
Nævnte enzymer kan producere symmetriske snit i målsekvensen (i begge kæder i samme højde) eller asymmetriske snit. Et nøgleaspekt ved virkningen af restriktionsenzymer er, at der efter spaltning af kæderne opnås en "løs kant", komplementær til den anden kant, der er skåret af det samme enzym..
Nogle eksempler er ECOR 1 og Sma 1. I øjeblikket er mere end 200 typer restriktionsenzymer kendte og kommercielt tilgængelige..
For at være nyttigt skal en saks ledsages af limen. Denne forseglingsvirkning af DNA (tidligere behandlet med restriktionsenzymer) udføres af ligaser.
Nedenfor vil vi beskrive de vigtigste trin, som rekombinant DNA-teknologi kræver. Alle udføres af fagfolk i et molekylærbiologisk laboratorium.
Før vi fortsætter med den eksperimentelle protokol, skal vi bemærke, at udtrykket "klon" og verbet "klon" i molekylærbiologi og bioteknologi er meget udbredt. Dette kan føre til forvirring.
I denne sammenhæng henviser vi ikke til kloning af alt en organisme (som for eksempel det berømte får Dolly), men til kloning af et DNA-fragment, som kan være et gen. Det vil sige, fremstille mange kopier - genetisk identiske - af sekvensen.
Det første trin er at beslutte, hvilken sekvens du vil bruge. Dette afhænger helt af forskeren og målene for hans arbejde. Dette DNA skal derefter isoleres og oprenses. Metoderne og procedurerne for at opnå dette afhænger igen af kroppen og vævet.
Generelt tages et stykke væv og underkastes behandling i en lysepuffer med proteinase K (et proteolytisk enzym), og derefter ekstraheres DNA'et. Derefter fragmenteres det genetiske materiale i små fragmenter.
Efter de forberedende trin søger forskeren at introducere DNA-segmentet af interesse i en kloningsvektor. Fra nu af kalder vi dette segment af DNA for hvidt DNA.
En af de mest anvendte vektorer i et plasmid af bakteriel oprindelse. Et plasmid er et dobbeltstrenget, cirkulært DNA-molekyle, der findes naturligt i bakterier. De er fremmede for det bakterielle kromosom - det vil sige de er ekstrachromosomale og findes naturligt i disse prokaryoter.
De grundlæggende elementer i en vektor er: (a) en replikationsorigin, som muliggør DNA-syntese; (b) selektionsmiddel, som gør det muligt at identificere de organismer, der bærer plasmidet med mål-DNA'et, såsom resistens over for noget antibiotikum; og (c) multikloningssted, hvor sekvenserne, der vil blive genkendt af restriktionsenzymerne, findes..
Det første vellykkede rekombinante DNA i laboratoriet blev klonet ind i plasmidet pSC101 fra bakterien E coli. Den indeholder et restriktionssted for restriktionsenzymet EcoRI og et antibiotikaresistensgen ud over replikationsstartstedet..
Indsættelsen af mål-DNA'et i plasmidet udføres under anvendelse af de molekylære værktøjer til restriktionsenzymer og ligaser beskrevet i det foregående afsnit..
Ud over plasmider kan DNA indsættes i en anden vektor, såsom bakteriofag lambda, cosmider, YAC'er (gærkunstige kromosomer), BAC'er (bakterielle kunstige kromosomer) og fagmider..
Når først det rekombinante DNA-molekyle (gen af interesse i plasmidet eller en anden vektor) er opnået, indføres det i en vært eller værtsorganisme, som kan være en bakterie..
For at introducere fremmed DNA i en bakterie anvendes en teknik kaldet bakteriel transformation, hvor organismen udsættes for en behandling med divalente kationer, der gør den modtagelig for DNA-optagelse..
Metodisk kan vi ikke garantere, at 100% af bakterierne i vores kultur effektivt har optaget vores rekombinante DNA-molekyle. Det er her, den del af plasmidet, der indeholder antibiotikaresistens, kommer i spil..
Således vil de bakterier, der har optaget plasmidet, være resistente over for et bestemt antibiotikum. For at vælge dem vil det være tilstrækkeligt at anvende antibiotikumet og tage de overlevende.
Efter at have valgt bakterierne med vores rekombinante DNA, fortsætter vi med at bruge værtens enzymatiske maskiner til at generere proteinproduktet af interesse. Når bakterierne reproducerer, overføres plasmidet til deres afkom, så det går ikke tabt under deling..
Denne procedure bruger bakterierne som en slags protein "fabrik". Senere vil vi se, at det har været en meget relevant procedure i udviklingen af effektive medicinske behandlinger..
Når kulturen er klar, og bakterierne har produceret store mængder protein, lyseres eller forstyrres cellen. Der er en bred vifte af biokemiske teknikker, der muliggør oprensning af proteiner i henhold til deres fysisk-kemiske egenskaber..
I en anden eksperimentel sammenhæng er vi måske ikke interesseret i at generere proteinet, men snarere er vi interesserede i at opnå DNA-sekvensen i sig selv. Hvis dette var tilfældet, ville plasmidet blive brugt til at skabe flere kopier af fragmentet af interesse for at have nok af mål-DNA'et til at udføre de relevante eksperimenter..
Rekombinant DNA-teknologi åbnede et uendeligt antal muligheder inden for molekylærbiologi, bioteknologi, medicin og andre relaterede områder. Dens mest fremragende applikationer er følgende.
Den første anvendelse er direkte relateret til molekylærbiologiske laboratorier. Rekombinant DNA-teknologi gør det muligt for forskere at forstå generens normale funktion, og de genererede proteiner kan bruges i yderligere forskning..
Proteiner produceret ved hjælp af den rekombinante DNA-procedure har anvendelser inden for medicin. To meget relevante eksempler på området er humant insulin og væksthormon, som anvendes til patienter, der mangler dette protein..
Takket være rekombinant DNA kan disse proteiner genereres uden behov for at ekstrahere dem fra et andet menneske, hvilket repræsenterer yderligere metodologiske komplikationer og sundhedsrisici. Dette har bidraget til at forbedre livskvaliteten for utallige patienter..
Endnu ingen kommentarer