Det bakteriel udstrygning er en tyndfilmforlængelse af en suspension af bakterielle mikroorganismer, der er lavet på en gennemsigtig glasplade eller glide til observation under et optisk mikroskop.
Udvidelsen i form af en film udføres for at adskille mikroorganismerne så meget som muligt, da observationen ikke er klar, hvis de er grupperet..
I studiet af bakteriekulturer bruges tilberedning, fiksering og farvningsteknikker til udtværing til bedre at analysere dem. På grund af den lille størrelse af mikroorganismer er brugen af et optisk mikroskop nødvendigvis nødvendig for deres observation..
Optiske mikroskoper er uundværlige instrumenter til at observere udstrygninger. Disse anvender optiske linser og lys, der gør det muligt at se prøverne med stor forstørrelse..
Generelt har levende celler ikke for det meste farvede strukturer, set med lysmikroskopet er de farveløse, gennemsigtige prøver, og de viser meget lidt intern kontrast og med deres miljø..
Observation med det enkle lysfeltoptiske mikroskop uden brug af hjælpefarvningsteknikker er meget begrænset og bruges kun i nogle tilfælde, såsom i observation af bevægelse af mikroorganismer.
For optimal observation af mikroorganismer skal der skabes en balance mellem kontrast og opløsning. Celledetaljer kan ikke ses under mikroskopet, selv med høj opløsning; brugen af farvestoffer kræves gennem farvningsteknikker, som giver kontrast til observation.
Artikelindeks
For at opnå fremragende kontrast kaldes der sofistikerede mikroskoper fasekontrastmikroskop, differentielt interferensmikroskop og mørkt feltmikroskop. Denne type mikroskop bruges til at observere bakteriestrukturer såsom kapper og filamenter, blandt andre..
Farvning er en simpel teknik til at øge kontrasten, der opnås med et lysfeltmikroskop. I denne teknik kan forskellige farvestoffer bruges, der forbedrer mikroskopisk observation signifikant..
Pletterne udføres direkte på udtværing eller forlængelse af suspensioner af mikroorganismer på objektglassene, tidligere tørret og fikseret..
Fixering er en teknik, der bruges til at bevare cellestrukturer; forårsager inaktivering af mikroorganismer og vedhæftning til glasset i objektglasset. Der er forskellige fiksationsbehandlinger: varmefiksering og kemisk fiksering.
Dette er den mest anvendte metode til observation af bakterieudstrygninger. Teknikken består i at føre den bakterielle suspension af udstrygningen gennem en lighter. Denne teknik er i stand til at bevare bakteriernes eksterne morfologi, men ødelægger deres indre strukturer..
Kemisk fiksering bruger konserveringskemikalier, såsom formaldehyd eller formaldehyd, ethanol og eddikesyre, blandt andre. Fordelen ved at anvende kemiske fikseringsmidler er, at bevarelsen af de indre cellulære strukturer i mikroorganismerne opnås..
De mest almindelige procedurer til farvning af en tidligere tørret og fast udstrygning er positiv eller simpel farvning, differentiel farvning og negativ farvning. Der er også specielle teknikker til farvning af bestemte cellestrukturer (kapsel, spore, flagella).
Positiv eller simpel farvning er den mest anvendte udstrygningsteknik. Det bruger farvestoffer, der har evnen til at binde til visse mikrobielle strukturer, så de kan observeres under et mikroskop.
Disse farvestoffer har kromoforgrupper (farvet del) i deres kemiske struktur med alternerende dobbeltbindinger og enkeltbindinger (konjugation). Disse bindinger kan igen etablere ioniske eller kovalente bindinger med nogle cellulære strukturer..
Pletterne, der anvendes til positiv eller simpel farvning, er for det meste kemiske derivater af anilin (farvede organiske salte).
På den anden side kan vi blandt farvestofferne finde nogle med en basisk pH og andre med en sur pH..
I basale farvestoffer har kromoforgruppen en positiv elektrisk ladning. Langt størstedelen af prokaryote mikroorganismer har en neutral indre pH, og deres celleoverflade er negativt ladet. Gennem denne elektrostatiske interaktion binder kromoforen til cellen og pletter den.
Eksempler på basiske farvestoffer er blandt andet methylenblåt, krystalviolet, malakitgrønt, basisk fuscin, safranin..
I syrefarvestoffer har kromoforgruppen en negativ elektrisk ladning. Disse bruges til at plette proteiner med positivt ladede aminogrupper. Eksempler på syrefarvestoffer er syrefuscin, rosenbengal, Congorød og eosin.
Den differentielle farvningsteknik består i at anvende to farvestoffer med forskellig farve eller intensitet for at skelne mellem forskellige mikroorganismer under mikroskopet. Gramplet og syre-alkoholresistent plet er de mest anvendte differentielle pletter inden for bakteriologi.
Gram-pletten bruges som en indledende test for at kende form, størrelse, cellegruppering samt typen af cellevæg. Ved hjælp af Gram-plettetesten klassificeres cellevægsbakterier i Gram-positive bakterier og Gram-negative bakterier..
I denne teknik anvendes kemiske farvestoffer, der ikke trænger ind i celleindretningen, men gør mediet, hvor mikroorganismerne vises, som en sort baggrund..
I den negative farvningsteknik fremstilles udstrygningen med en dråbe Indien-blæk eller nigrosinsuspension, som efter at have tilladt tørring ved stuetemperatur danner en film, der er uigennemsigtig for lysets passage. På denne måde ses mikroorganismer som lyse former på en mørk baggrund..
1.- Vask objektglassene meget godt, tør dem med absorberende papir og mærk dem. Mærkaten skal angive præparatets indhold, dato og navn på den person, der har behandlet det..
2. - Tænd lighter og steriliser inokulationssløjfen i flammen, indtil den er rød.
3.- Lad håndtaget køle af.
4.- Tag bakteriedyrkningsrøret, fjern hætten og før hurtigt mundingen af røret nær brænderens flamme (flamme).
5.- Indsæt podningssløjfen i røret, der indeholder bakteriekulturen, og tag prøven.
6. - Hvis kulturen er i flydende medium, skal du placere prøven taget med håndtaget i midten af objektglasset og sprede den forsigtigt i en cirkel på ca. 2 cm i diameter..
7. - Sterilisér inokulationssløjfen igen.
8. - Lad udtværingen tørre i luften.
9.- Gentag trin 3 til 8 tre gange.
10. - Hvis kulturen er i fast medium, skal der tidligere placeres en dråbe destilleret vand på objektglasset. Dette gøres for at blande en lille prøve af kulturen taget med inokulationssløjfen, som beskrevet i trin 2 til 5 (aseptiske forhold).
11. - Spred den fortyndede prøve med dråben vand på objektglasset og gentag tre gange.
1.- Tilsæt to dråber methanol eller absolut ethanol til de tørre udtværinger fra kulturer i flydende medium..
2. - Lad lufttørre væk fra lighter.
3.- Hvis udstrygningen kommer fra en kultur på fast medium, fastgøres den tørre udstrygning med varme og passerer den hurtigt 2 til 3 gange gennem den varmeste del af den lettere flamme..
4.- Berør den nedre del af udstrygningen med den venstre dorsale del (for højrehåndere; ellers brug højre hånd) og kontroller, at den er kold.
1.- Tilsæt 2 dråber af den valgte plet til udtværingen, og lad det virke i den tid, der kræves i de specifikke protokoller for hver plet (normalt mellem 1 og 5 minutter).
2.- Nogle pletter kræver brug af varme til deres aktivering, i hvilket tilfælde man skal være meget forsigtig, når man glider lyset op i lysere flamme (manipuler det med en pincet og undgå kogning). En overophedning af udstrygningen kan ødelægge de celler, der skal observeres..
3.- Fjern overskydende farvestof ved at vaske med destilleret vand fra en picette. Fjern vaskevandet ved at banke forsigtigt på objektglasset på kanten, vippet på arbejdsbordet.
4.- Tillad lufttørring.
5.- Afhængigt af typen af observation anvendes et dækglas eller ikke på dette tidspunkt. Dækglas beskytter og bevarer udstrygningen. Hvis der foretages en olieinddypningsobservation på dette stadium, anvendes der ikke dækglas, men udstrygningen kan ikke bevares.
1.- Fordy udtværingen successivt i hver af nedenstående opløsninger i mindst 5 minutter. Formålet med disse "bade" er at lade udtværingen være helt dehydreret. Hvert reagens skal drænes godt, før udtværingen indføres i det næste bad..
Rækkefølgen af dehydratiseringsbade er som følger:
Lad derefter lufttørre.
2. - Monter dækglas, fortrinsvis 22 × 22 mm, med Canada balsam eller andet monteringsmedium.
Endnu ingen kommentarer