Oxidase test begrundelse, procedure og anvendelser

1935
Alexander Pearson

Det oxidasetest Det er en diagnostisk metode, der viser tilstedeværelsen af ​​enzymkomplekset kaldet cytochromoxidase c. Dette system inducerer transformation af cytochrom reduceret til oxideret, da det fanger ilt og dette igen fungerer som den sidste elektronacceptor (H+) i åndedrætskæden.

Udtrykket oxidase er en stenografisk måde at henvise til enzymet cytochromoxidase, også kendt som indophenoloxidase. I gamle tider blev det antaget, at enzymerne cytochromoxidase og indophenoloxidase var to forskellige enzymer, men i dag vides de at være de samme.

Positiv og negativ oxidasetest. Kilde: Ingen maskinlæsbar forfatter angivet. Alpha.prim ~ commonswiki antages (baseret på krav om ophavsret). [Offentligt domæne]

For deres del er cytokromer hæmoproteiner, der indeholder jern og kompletterer cytochromoxidasesystemet. Cytokromer kan variere fra art til art.

Der findes forskellige varianter af cytokromer (cytokromer a1, a2, a3 og 0). Nogle bakterier kan kun producere en, men andre op til to eller tre ad gangen. I denne forstand er tilstedeværelsen af ​​cytochrom a og a3 kendt som cytochromoxidase c. Dette er den type cytochrom, som oxidasetesten detekterer..

Slægterne Neisseria og Pseudomonas indeholder cytochromoxidase c. Disse slægter giver den positive oxidasetest og hjælper med at skelne dem fra henholdsvis slægterne Acinetobacter og Stenotrophomonas..

Der er også andre slægter, der er oxidase positive.

Artikelindeks

  • 1 begrundelse
    • 1.1 Egenskaber ved cytochromoxidase c-systemet
    • 1.2 Princip for testen
  • 2 Fremgangsmåde
    • 2.1 Reagenser
    • 2.2 Protokoller
  • 3 Brug
  • 4 Kvalitetskontrol
  • 5 Begrænsninger
  • 6 anbefalinger
  • 7 Referencer

Basis

Karakteristika for cytochrom oxidase c-systemet

Cytochromoxidase c-systemet fungerer som følger: oxidase-positive mikroorganismer bruger ilt til at generere energi gennem aerob respiration. Dette system fungerer takket være transport af elektroner fra donorstoffer som NADH+ mod receptorsubstanser, i dette tilfælde ilt.

Dette resulterer i produktion af energi (ATP) og vand eller hydrogenperoxid, afhængigt af det cytochromoxidasesystem, som mikroorganismen besidder..

Derfor er de fleste oxidase-positive bakterier også katalase-positive, en nødvendig betingelse for at eliminere det producerede hydrogenperoxid, da dette stof er giftigt for bakterier..

Cytochromoxidase c-systemet er til stede i nogle aerobe bakterier, nogle fakultative anaerober, få mikroaerofile og ingen strenge anaerober. Sidstnævnte er forståeligt, da strenge anaerober ikke kan leve i nærvær af ilt, derfor mangler de cytochromoxidasesystemet..

Testprincip

I denne test bruger det stoffer, der fungerer som kunstige elektronacceptorer, der erstatter naturlige inden for elektrontransportkæden..

Der anvendes primært farvestoffer såsom paraphenylendiamin og indophenol, der fungerer som receptorsubstrater og kunstige elektrondonorer.

Paraphenylendiamin oxideres af cytochrom oxidase c-systemet. Farvestoffet i dets reducerede form er farveløst, men i dets oxiderede form er det farvet.

Dette er, hvordan tilstedeværelsen af ​​cytochromoxidase c-systemet påvises; da en positiv reaktion vil generere en lavendel eller blå-lilla farve afhængigt af det anvendte reagens.

På den anden side, hvis det sidste elektronacceptive stof i åndedrætskæden er forskelligt fra ilt, vil oxidasetesten være negativ (der er ingen farveproduktion); dette er tilfældet med anaerobe mikroorganismer.

Ligeledes, hvis cytokromet, der anvendes af mikroorganismen, er forskelligt fra cytochromoxidase c, vil det også give den negative test..

Behandle

Der er forskellige reagenser og protokoller til oxidasetesten, alle til samme formål..

Reagenser

Kovacs reagens, Gordon og McLeod reagens, Nadi reagens, Carpenter, Suhrland og Morrison reagens og brug af oxidaseskiver.

-Kovacs oxidasereagens

Den består af 1% tetramethyl-p-phenylendiamindihydrochlorid.

Kovacs-reagenset fremstilles ved opløsning af 1 g af det førnævnte stof i 50 ml destilleret vand. Det opvarmes subtilt, indtil det er helt opløst. Overfør til en ravgul flaske med tilstrækkelig kapacitet, og fyld op til 100 ml med destilleret vand. Vent mindst 15 minutter inden brug. Opbevares i køleskab beskyttet mod lys.

Det er mærket Kovacs oxidase reagens for at skelne det fra det Kovacs reagens, der anvendes til at afsløre indolprøven. Dette reagens er det mest følsomme, mindre giftigt, men dyrere end resten af ​​reagenserne.

En positiv reaktion vil blive påvist med dette reagens med kolonifarveændringen til lavendel, som hurtigt bliver lilla næsten sort. En negativ reaktion er tydelig, fordi der ikke er nogen farveændring i kolonien, eller den får en let lyserød farve. Mediet kan også mørkere, men det betyder ikke en positiv reaktion.

Med dette reagens er reaktionstiden afgørende, en farveændring, der finder sted mellem 5 og 15 sekunder, betragtes som en positiv reaktion..

-Gordon og McLeods reagens

Den består af dimethyl-p-phenylendiamindihydrochlorid, også kendt som N-dimethyl-p-phenylendiamin eller p-aminodimethylanilinmonohydrochlorid. Det fremstilles som beskrevet for Kovacs oxidasereagenset og erstatter det involverede stof..

Dette reagens er lidt mere stabilt end Kovacs oxidasereagens, skønt alle reagenser indeholdende p-phenylendiamin er ustabile..

Denne reaktion fortolkes senere, den fortolkes som positiv med udseendet af en blå-lilla farve inden for 10 til 30 minutter..

-Nadi reagens

Den består af 1% α-naphthol i ethylalkohol (95% ethanol) og 1% aminodimethylanilin. Blandingen fremstilles i lige store dele og under anvendelse af absolut ethylalkohol som et fortyndingsmiddel, indtil den tilstrækkelige mængde er afsluttet til 100 ml.

-Tømrer, Suhrland og Morrison reagens

Den består af 1% p-aminodimethylalaninoxalat. Forbered på samme måde som beskrevet for Kovacs oxidasereagens, og skift til det tilsvarende stof.

Med opløsningen klar skal du fremstille teststrimler som følger: 6-8 cm Whatman nr. 1 filterpapirstrimler er imprægneret med 1% dimethyl-p-phenylendiaminoxalatreagens.

De lades tørre uden kontakt med metal, opbevares i skruelågsbeholdere med tørremiddel og opbevares i køleskab. Disse strimler er stabile i op til 6 måneder.

Det er det mest stabile reagens af alle de nævnte og kan vare op til 6 måneder i opløsning. Et andet plus er, at det ikke farve mediet omkring kolonien, hvis det bruges direkte på pladen.

Udseendet af en rød farve fortolkes som en positiv test.

-Oxidase skiver

De er kommercielle diske, der er imprægneret med reagens til oxidasetesten. Der er flere kommercielle mærker på markedet.

Dens anvendelse er ret praktisk, da det ikke er nødvendigt at fremstille friske reagenser, hvilket letter arbejdet. De opnåede resultater er pålidelige, så længe diskene er korrekt bevarede.

Protokoller

Direkte plademetode, indirekte metode på papir og brug af diske imprægneret med oxidasereagenser.

-Direkte plademetode

2 eller 3 dråber af et hvilket som helst af de førnævnte reagenser tilsættes til dette formål direkte på kolonien eller kolonierne indeholdt i en plade af dyrkningsmedium, der ikke indeholder glucose..

Ændringen eller ej af farve i kolonierne fortolkes, ikke af mediet. Den gyldige reaktionstid afhænger af det anvendte reagens.

-Indirekte metode på papir

Skær et stykke filterpapir (Whatman nr. 1) til en størrelse på 6 cmto og anbragt i en tom petriskål.

Tilsæt 2 eller 3 dråber Kovacs oxidase-reagens på papiret, tag en del af kolonien, der skal undersøges, med et platinahåndtag eller en tandstikker af træ, og spred den i en lige linje på det reagensimprægnerede papir. Udfør inden for 5-10 sekunder.

Med strimlerne tilberedt med Carpenter, Suhrland og Morrison reagens spredes en koloni på den tørre strimmel. En enkelt strimmel bruges til at teste flere stammer. Fortolk på 10 sek.

-Skiver (mdirekte metode)

Fugt de kommercielle skiver subtilt med sterilt destilleret vand, og læg dem på kolonien, der skal undersøges. Det anbefales at bruge pladerne ved 35 ° C, hvis der anvendes plader ved stuetemperatur eller køleplader, er reaktionen lidt langsommere. Fortol farveændringen mellem 10 og 20 sek.

Kolonier indeholdt i blod eller chokoladeagar kan bruges.

-Diske (indirekte metode)

Fugt disken som beskrevet tidligere. Anbring den i en tom petriskål. Tag en tilstrækkelig mængde af kolonien til at studere med et platinahåndtag eller en tandstikker af træ, og læg den på disken. Fortol farveændringen mellem 10 og 20 sek.

Brug

Slægten Neisseria og Acinetobacter er undertiden meget ens morfologisk, for selvom slægten Acinetobacter er en gramnegativ stang, kan den undertiden tage en coccoidform og fordeles parvis og simulere slægten Neisseria..

I dette tilfælde er oxidasetesten virkelig nyttig. Slægten Neisseria er positiv og Acinetobacter negativ.

Dog er slægten Moraxella meget lig slægten Neisseria og begge giver en positiv reaktion; Derfor skal der altid udføres test af fermentering af kulhydrater til endelig identifikation.

På den anden side er oxidasetesten nyttig til at differentiere en bakterie, der hører til Enterobacteriaceae-familien (alle oxidase-negative) fra andre fermentorer, såsom slægten Pasteurella, Aeromonas, Plesiomonas (oxidase-positiv).

Slægten Vibrio og Helicobacter er også oxidase positive.

QA

Brug kendte stammer af Escherichia coli som en negativ kontrol og stammer af Pseudomonas aeruginosa som en positiv kontrol.

Begrænsninger

-Reagenserne skal bruges frisklavet, deres holdbarhed i opløsning ved stuetemperatur er kort, fordi de er meget ustabile. Nedkølet kan de vare mellem 5 dage og 2 uger.

-Reagenserne er farveløse, hvis de skifter farve, skal de kasseres. Beskadigede diske er tydelige, fordi de bliver mørkere over tid.

-En positiv reaktion med Kovacs oxidasereagenset mellem 15-60 sek betragtes som en forsinket reaktion, og efter 60 sekunder skal det betragtes som negativ.

-Det Haemophylus influenzae giver en negativ oxidasereaktion, hvis der anvendes et reagens med dimethyl-p-phenylendiamin, men positivt, hvis der anvendes Kovacs-oxidasereagens (tetramethyl-p-phenylendiamin).

-Medier, der indeholder glukose, forstyrrer testen og giver falske negativer.

-Stammer af Bordetella pertussis kan give en falsk positiv reaktion, hvis de kommer fra stærkt koncentrerede blodagarplader.

-Brug af metal (jern) håndtag giver en falsk positiv reaktion.

anbefalinger

-Da reagenserne er meget ustabile og har tendens til selvoxidering, anbefales det at fryse alikvoter på 1 til 2 ml og fjerne efter behov..

-En anden måde at forsinke auto-oxidationen af ​​reagenset er at tilsætte 0,1% ascorbinsyre, når reagenserne fremstilles..

-Da reagenserne er ustabile, anbefales en ugentlig kvalitetskontrol..

-Reagenser, der ikke opfylder kvalitetskontroltesten, bør ikke anvendes..

Referencer

  1. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologisk diagnose. 5. udgave Redaktionel Panamericana S.A. Argentina.
  2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey & Scott mikrobiologisk diagnose. 12. udgave Redaktionel Panamericana S.A. Argentina.
  3. "Oxidase Test." Wikipedia, The Free Encyclopedia. 15. jan 2018, 10:32 UTC. 3. apr 2019, 14:03
  4. Verdens Sundhedsorganisation. Laboratoriehåndbog til identifikation og antimikrobiel modtagelighedstest af bakterielle patogener af folkesundhedsmæssig betydning i den udviklende verden. 2004. Tilgængelig på: who.int/drugresistance/infosharing
  5. Teststrimler til diagnose af oxidaseaktivitet i bakterier. Rev Cubana Med Trop [Internet]. 2000; 52 (2): 150-151.

Endnu ingen kommentarer