Det Voges-Proskauer test er en biokemisk test, der bruges til at identificere bakterier, der hører til Enterobacteriaceae-familien. Det er især nyttigt til at differentiere stammer af Escherichia coli fra Klebsiella og Enterobacter, blandt andet.
Testen udføres i et flydende dyrkningsmedium kaldet Methyl Red-Voges Proskauer, bedre kendt under akronymet RM / VP. Dette medium er sammensat af bufret polypepton, glucose, dikaliumphosphat og destilleret vand..
Det nuværende RM / VP-medium er en modifikation af Clark and Lubs-mediet, som oprindeligt indeholdt en lavere koncentration af peptoner og glucose. Derfor blev mindre af hydrogenionen, der kræves til den positive Voges-Proskauer-reaktion, produceret..
Testen er baseret på mikroorganismens evne til at bruge glucose gennem butylen-glycol-ruten og danne et neutralt slutprodukt kaldet acetoin i nærvær af ilt og en alkalisk pH.
Foruden at være i stand til at afsløre Voges-Proskauer-testen kan den methylrøde test også afsløres i RM / VP-mediet..
Artikelindeks
Pluripeptonerne til stede i mediet tilvejebringer de essentielle ernæringsmæssige krav til bakterievækst. For sin del er glukose den vigtigste forbindelse. Mange bakterier har evnen til at metabolisere glukose og danne pyruvinsyre.
Pyruvinsyre er et midtpunkt i glukosemetabolismen, og derfra kan hver mikroorganisme tage forskellige ruter. Nogle vil danne blandede syrer, såsom mælkesyre, eddikesyre, myresyre og ravsyre, og andre vil danne neutrale produkter som 2,3-butandiol..
Voges-Proskauer-testen afslører mikroorganismens evne til at danne acetylmethylcarbinol (acetoin), et mellemprodukt af 2,3-butandiol under aerobe forhold.
Acetoin reduceres og danner 2,3-butandiol, men denne reaktion er reversibel, så hvis 2,3-butandiol oxideres, dannes der acetoin. Derfor er ilt vigtigt.
Dikaliumphosphat er bufferen, der buffrer blandingen til pH 6,9 ± 0,2.
For at demonstrere reaktionen skal en udvikling udføres ved hjælp af to reagenser (Barrit reagenser), kendt som Voges A og Voges B.
Voges A er en 5% opløsning af α-naphthol, og Voges B er et 40% kaliumhydroxidpræparat. Hvis kaliumhydroxid ikke er tilgængeligt, kan det erstattes med 40% natriumhydroxid.
Α-Naphthol er en katalysator, der øger reaktionens farveintensitet, hvilket gør testen mere følsom. Α-naphthol skal altid tilsættes først, idet røret ryster, så mediet kommer i kontakt med iltet. På denne måde oxideres den tilstedeværende acetoin til diacetyl, og 2,3-butandiol oxideres til dannelse af acetoin, der overføres til diacetyl..
Dette er, hvordan α-naphthol vil binde til diacetyl, som igen har tilsluttet sig guanidinkernen, der er til stede i aminosyren arginin, hvor sidstnævnte kommer fra pluripeptoner.
På sin side er kalium eller natriumhydroxid ansvarlig for at absorbere COto og at reagere med peptoner. Denne reaktion forårsager dannelsen af en lakserød farve, der er tydelig synlig efter rystning af røret meget godt..
Korrekte mængder diacetyl, pepton og α-naphthol skal blandes for at farve kan forekomme med det samme. Hvis dette ikke sker, får røret lov til at hvile i 15 minutter, før det fortolkes..
Normalt er testen positiv efter 2 til 5 minutter, når en svag lyserød farve kan ses. Hvis den får lov til at hvile i 30 minutter til 1 time, vil farveens intensitet være maksimal (intens rød).
En negativ test vises, når bouillon bliver gul. Hvis testen er negativ, kan der efter 1 time dannes en kobberfarve som følge af reaktionen af kaliumhydroxid på α-naphthol.
Vej 17 g af det dehydrerede dyrkningsmedium og opløses i en liter destilleret vand. Lad stå i 5 minutter. Varm op til kog for at opløses fuldstændigt. Serveres 3 til 4 ml i rør og steriliseres i autoklave ved 121 ° C i 15 minutter.
Det dehydrerede dyrkningsmedium er beige i farven, og det fremstillede medium er lysegult i farven..
Mediets endelige pH er 6,9 ± 0,2.
Afvej 5 g α-naphthol og opløses i 50 ml ethylalkohol (absolut). Fortsæt derefter med at tilsætte ethylalkohol, indtil den når 100 ml..
Vej 40 g kaliumhydroxid og opløses i 50 ml destilleret vand i et bægerglas. Glasset skal placeres i et koldt vandbad for at kontrollere temperaturen, for når præparatet er opløst, stiger temperaturen kraftigt.
Efter at opløsningen er kold overføres den til en målekolbe og fyldes op til 100 ml med destilleret vand..
For at udføre Voges-Proskauer-testen inokuleres en RM / VP-bouillon med den mikroorganisme, der undersøges, fra en ren kultur i 18 til 24 timer..
Inokulumet skal ikke være meget tæt. Det inkuberes ved 35-37 ° C i 24 til 48 timer, selvom inkubation i flere dage undertiden er nødvendig. Cowan og Steel mener, at 5 dage er den minimale inkubationstid, der er nødvendig for at opdage alle positive Voges-Proskauer (VP) arter af Enterobacteriaceae-familien..
Separer en alikvot på 1 ml i et rør og udvikl som følger: Anbring 12 dråber (0,6 ml) Voges A-reagens og 4 dråber (0,2 ml) Voges B. Bland til luftning og lad det sætte sig i 5-10 minutter inden fortolkning. Hvis testen stadig er negativ, skal den dog sidde og observere røret efter 30 minutter til 1 time..
Udseendet af en lyserød-rød farve indikerer, at Voges-Proskauer-reaktionen er positiv. Hvis mediet forbliver gult, er reaktionen negativ.
Det er vigtigt at tilføje udviklere i den angivne rækkefølge og mængde for at undgå falske negativer..
Voges-Proskauer-testen er nyttig til at skelne mellem stammer af E coli der er VP-negative af slægterne Klebsiella, Enterobacter, Serratia, blandt andre, der er VP-positive.
Kontrolstammer kan bruges til at teste kvaliteten af det forberedte medium inklusive Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 700603, Proteus mirabilis ATCC 43071, Salmonella typhimurium og Enterobacter cloacae ATCC 13047.
Forventede resultater er kun positive Voges-Proskauer-reaktioner til K. pneumoniae Y E. cloacae. Resten giver negative reaktioner.
Endnu ingen kommentarer