Det proteinase K Det er et enzym, der tilhører gruppen af serinproteaser, det vil sige, det har en aminosyreserin i sit aktive katalytiske centrum og har den funktion at bryde peptidbindinger ved hydrolyse. Til gengæld hører dette enzym til familien af subtilisinproteiner (peptidase S8).
Proteinase K har en molekylvægt (MW) på 28.900 dalton og blev isoleret for første gang i 1974 i svampekstrakter. Engyodontium album, tidligere kendt som Tritirachium album Limber.
Det har en høj proteolytisk kapacitet, demonstreret ved at være i stand til at nedbryde den keratin, der findes i håret. Ordet keratin på engelsk er skrevet "keratin", derfor er det blevet kaldt "proteinase K".
På grund af dets høje styrke til at spalte native proteiner er dette enzym nyttigt i forskellige molekylærbiologiske teknikker. Bruges primært til at isolere og fremstille nukleinsyrer med høj molekylvægt (MW).
Proteinase K virker ved at frigive nukleart DNA, mens den ødelægger proteiner og inaktiverer RNaser og DNaser, det vil sige, det eliminerer nukleaser i DNA- og RNA-præparater..
På den anden side er det blevet set, at proteinase K kan hydrolysere nogle denaturerede native proteiner, hvilket har vækket forskernes interesse for dets anvendelse i studiet af prionproteiner (PrPC).
På trods af deres høje proteolytiske styrke er der imidlertid proteiner, der er resistente over for virkningen af proteinase K. Blandt dem er nogle unormale proteiner kaldet prioner (PrPSc), der er forbundet med overførbare spongiforme encephalopatier..
Artikelindeks
Proteinase K har en tertiær struktur, der består af tre lag, med et syvkædet β-ark, der er anbragt mellem to lag helixer. Fordi det hører til S8-familien af peptidaser, er det karakteriseret ved at have en katalytisk triade i sit aktive sted, hvis sekventielle rækkefølge er (Asp, His og Ser), som adskiller dem fra andre familier af peptidaser..
Dette enzym fra gruppen af serinproteaser er kendetegnet ved hydrolyse af peptidbindingerne tæt på den carboxyliske gruppe af alifatiske og aromatiske aminosyrer..
På den anden side er det i stand til at virke i nærværelse af visse ætsende stoffer, såsom natriumdodecylsulfat (SDS), Tris-HCL og EDTA, som bruges til at hjælpe denaturering af proteiner, hvilket får dem til at miste deres oprindelige struktur ..
Dette er et indledende trin i fremstillingen af proteiner til elektroforeseteknikken. PH-området, hvor proteinase K virker, er ret bredt (2,0 til 12,0) med en optimal pH mellem 7,5 og 12,0, og dets isoelektriske punkt er 8,9. Som det kan ses, er det aktivt mod et meget bredt pH-område..
En anden egenskab, der skiller sig ud i proteinase K, er dens stabilitet i nærvær af høje temperaturer (50 - 60 ° C)..
Proteinase K kræver tilstedeværelsen af calciumionen, skønt dette ikke påvirker dens aktivitet, hvis det er vigtigt for at opretholde dets stabilitet.
For at proteinase K skal fordøje substratet fuldt ud, er det nødvendigt med en kontakttid på ca. 5 minutter til 2 timer..
I denne forstand sammenlignede Daza et al. Imidlertid renheden af DNA opnået ved forskellige eksponeringstider mod proteinase K og konkluderede, at en langvarig inkubation (op til 24 timer) forbedrer kvaliteten af DNA betydeligt..
I forhold til koncentrationen af proteinase K-enzymet, der anvendes i de forskellige protokoller, kan det siges, at det er meget varieret.
Det kan bruges fra meget lave koncentrationer (5 µg / ml) til koncentrationer på 500 µg / ml. Men de mest hyppige arbejdskoncentrationer spænder fra 50-100 μg / ml, især til fordøjelse af proteiner og nukleaseinaktivering. Selvom der kræves en koncentration på 2 mg / ml til behandling af væv.
Dens anvendelser er meget brede og kan sammenfattes som følger:
-Det bruges til fordøjelse af proteiner og DNA-ekstraktion ved forskellige metoder såsom: saltning, PK-SDS, cetyl-trimethylammoniumbromid (CTAB), modificeret kaliumacetat og ekstraktion med natriumiodid..
-Nukleaseinaktivering (RNaser og DNaser).
-I hybridiseringsteknikken in situ (HIS) for at hjælpe med frigivelse af nukleinsyrer ud over at fjerne uønskede proteiner.
-Protein modifikation.
-På forskningsniveau i forskellige undersøgelser.
Flere sammenlignende undersøgelser er blevet udført mellem DNA-ekstraktionsteknikker, der bruger Proteinase K, med andre, der ikke bruger det, og alle konkluderer, at der er større fordele ved anvendelse af enzymet. Fordele inkluderer følgende:
-Der opnås DNA med høj molekylvægt, høj kvalitet og renhed.
-Det ekstraherede DNA er stabilt i op til 3 måneder.
Det ekstraherede DNA kan anvendes i følgende teknikker: Southern blot, polymerasekædereaktion (PCR), elektroforese, blandt andre..
Forskellige undersøgelser har konkluderet, at prioner (unormale toksiske PrPSc-proteiner) adskiller sig fra PrPC (native) proteiner ved at være resistente over for virkningen af proteinase K, mens PrPC'er er følsomme over for dens virkning.
Andre forfattere har beskrevet, at der i strukturen af PrPSc er følsomme dele, og andre resistente over for proteinase K. Imidlertid er begge dele lige så giftige og infektiøse.
På den anden side isolerede Bastian et al. I 1987 4 proteiner på 28, 30, 66 og 76 kda fra en art af Spiroplasma mirum. Alle viste sig at være resistente over for virkningen af proteinase K og havde også en krydsreaktion med nogle prioner..
Det er kendt, at denne art kan forårsage grå stær og signifikant neurologisk skade, og på grund af Bastians videnskabelige fund er der blandt andet gjort forsøg på at forbinde denne mikroorganisme med overførbare spongiforme encephalopatier..
Etiologien af denne degenerative neurologiske patologi tilskrives imidlertid fortsat prioner i dag..
I denne forstand identificerede og karakteriserede Butler et al. I 1991 en klasse proteinresistent over for proteinase K på 40 kda fra to stammer af Mycoplasma hyorhinis. Dette patogen påvirker grise og inficerer deres væv, men i dette tilfælde var der ingen krydsreaktion med de testede prioner..
Mere forskning er nødvendig for at belyse mange ukendte i denne henseende.
Endnu ingen kommentarer